ЭРХПГ-индуцированный и не-ЭРХПГ-индуцированный острый панкреатит: две разные клинические и иммунологические сущности?

ПРОТОКОЛ:

Все пациенты с показаниями к эндоскопической ретроградной холангиопанкреатографии (ЭРХПГ) будут подготовлены к ЭРХПГ по следующему протоколу: они будут проинструктированы не есть за 4–6 часов до процедуры. Непосредственно перед процедурой им вводят суппозитории Диклофенак натрия 100 мг. За час до процедуры будет взято 10 мл пробы крови и мочи, которые будут проанализированы в лабораторных помещениях Университетского больничного центра Риеки на следующие параметры: значения амилазы в сыворотке и моче и липазы в сыворотке, тесты на печеночные ферменты и функцию почек. Через 4-6 часов после выполнения ЭРХПГ берется 10 мл образца крови и анализируется в лабораторных помещениях, включенных в Университетский больничный центр Риеки, на следующие параметры: значения амилазы в сыворотке и моче и липазы в сыворотке, тесты ферментов печени и функция почек. .

Через 24 часа после процедуры у всех пациентов будет взято по 30 мл гепаринизированной периферической венозной крови и мочи. 10 мл будут исследованы в отделении лабораторной медицины Клинического больничного центра по следующим параметрам: значения амилазы в сыворотке и моче и липазы в сыворотке, анализы ферментов печени и функции почек. Образец мочи, собранный после процедуры, будет использоваться для оценки уровня амилазы. Остальные 20 мл образцов крови будут отправлены на кафедру физиологии и иммунологии медицинского факультета, где будет проведен иммунологический анализ. Все пациенты, перенесшие ЭРХПГ, будут разделены на две группы. Первая группа (группа ПКП) будет состоять из пациентов, у которых развился острый панкреатит после ЭРХПГ. После клинического и лабораторного подтверждения острого панкреатита в соответствии с рекомендациями Европейского общества желудочно-кишечной эндоскопии (ESGE) для пост-ERCP панкреатита будет проводиться дальнейший мониторинг во время госпитализации для оценки тяжести заболевания. Тяжесть заболевания будет оцениваться в соответствии с критериями Коттона для тяжести панкреатита после ЭРХПГ. Группа пациентов, перенесших ЭРХПГ, но не развивших острый панкреатит в течение 24 часов после процедуры, согласно рекомендациям ESGE, будет использоваться в качестве контрольной группы (группа без ПКП).

Всем пациентам с острым панкреатитом по критериям Atlanta, поступившим в отделение неотложной помощи, через 24 часа после появления клинических симптомов (боли в верхней части живота, часто иррадиирующие в спину) берут 30 мл гепаринизированной периферической венозной крови и мочи. 10 мл собранных образцов крови будут исследованы в отделении лабораторной медицины Клинического больничного центра по следующим параметрам: значения амилазы в сыворотке и моче и липазы в сыворотке, ферментные тесты печени и функция почек. Остальные 20 мл образцов крови будут отправлены на кафедру физиологии и иммунологии медицинского факультета, где будет проведен иммунологический анализ. Эта группа пациентов будет находиться под наблюдением во время госпитализации для оценки тяжести заболевания. Тяжесть заболевания будет оцениваться в соответствии с критериями Атланты.

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

Лабораторные параметры

Для каждого пациента, включенного в исследование, анализ крови и мочи будет проводиться в отделении лабораторной медицины Центра клинической больницы Риека. Основные гематологические тесты будут включать: общий анализ крови - подсчет общего количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов, присутствующих в крови, значения гемоглобина и гематокрита. Биохимический анализ сыворотки крови будет включать: значения амилазы и липазы в сыворотке, натрия, калия, глюкозы, ферментов печени (аспартатаминотрансфераза (АСТ), аланинаминотрансфераза (АЛТ), Гама-глутамилтрансфераза (ГГТ), щелочная фосфатаза (ЩФ). ) прямой и непрямой билирубин, функция почек (мочевина и креатинин сыворотки, оценка клубочковой фильтрации (рСКФ)), С-реактивный белок и кислотно-основное состояние артериальной крови.

Иммунологические методы

Для каждого пациента, включенного в исследование, иммунологический анализ образцов крови (через 24 часа после процедуры или появления симптомов) будет проводиться в отделении физиологии и иммунологии Медицинской школы в Риеке, Хорватия.

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови Двадцать миллилитров периферической крови собирают в Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY), накладывают на Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Осло, Норвегия) и центрифугируют (20 мин при 600 g). После центрифугирования клетки с поверхности раздела собирают и дважды промывают в среде Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Окленд, Новая Зеландия) и сразу же используют для дальнейших экспериментальных процедур. Жизнеспособность клеток >95% будет оцениваться с помощью йодида пропидия 0,5 мг/мл/106 клеток (Sigma-Aldrich Chemie) и проточного цитометра (FACSCalibur, Becton Dickinson, Сан-Хосе, США).

Обнаружение клеточной поверхности Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) будут окрашиваться в течение 30 минут при 40 градусах Цельсия различными комбинациями фикоэритрина (PE) - цианина (Cy) против кластера дифференцировки (CD) 3 моноклонального антитела (мышиное антитело (mAb) ), иммуноглобулин G 1 (IgG1)), PE-конъюгированные антикластерные дифференцировочные (CD) 56 mAb (мыши B159, IgG1) и флуоресцеинизотиоцианат (FITC)-конъюгированные анти-естественные киллеры группы 2, член D (NKG2D) мАт (5C6). Конъюгированные с FITC-, PE- и PE-Cy мышиные антитела, соответствующие изотипу, будут использоваться для установки отрицательных контролей для каждого класса используемых антител.

Образцы окрашенных клеток будут анализировать с помощью проточной цитометрии с использованием проточного цитометра FACSCalibur (Becton Dickinson & Co, Сан-Хосе, США).

Обнаружение цитокина интерлейкина (IL)-1 бета (β) и белка теплового шока (HSP) 70, 27.

Для количественного определения концентраций человеческого IL-1β в плазме будет использоваться набор Human IL-1 ELISA (иммуноферментный анализ).

Для количественного определения белков теплового шока (HSP) 70 и 27 в плазме будут использоваться наборы для высокочувствительного ELISA для HSP 70 и наборы для ELISA для HSP 27.

Обнаружение пентраксина 3 (РТХ 3) и прокальцитонина Для количественного определения концентраций пентраксина 3 (РТХ) и прокальцитонина человека в плазме будет использоваться специальный набор ELISA.