Pancreatite acuta indotta da ERCP e non indotta da ERCP: due distinte entità cliniche e immunologiche?

PROTOCOLLO:

Tutti i pazienti con indicazione per colangiopancreatografia retrograda endoscopica (ERCP) saranno preparati per ERCP sul seguente protocollo: saranno istruiti a non mangiare da 4 a 6 ore prima della procedura. Immediatamente prima della procedura verranno somministrate supposte di Diclophenac Sodium 100 mg. Un'ora prima della procedura 10 ml di campione di sangue e campione di urina saranno prelevati e analizzati nei locali di laboratorio incorporati nel Centro Ospedaliero Universitario di Rijeka per i seguenti parametri: valori di amilasi nel siero e nelle urine e lipasi nel siero, test degli enzimi epatici e funzionalità renale. 4-6 ore dopo l'esecuzione dell'ERCP, verranno prelevati 10 ml di campione di sangue e analizzati nei locali di laboratorio incorporati nel Centro Ospedaliero Universitario di Rijeka per i seguenti parametri: valori di amilasi nel siero e nelle urine e lipasi nel siero, test degli enzimi epatici e funzionalità renale .

24 ore dopo la procedura, a tutti i pazienti verranno prelevati 30 ml di sangue venoso periferico eparinizzato e un campione di urina. 10 mL saranno esaminati presso il Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Centro Clinico Ospedaliero per i seguenti parametri: valori di amilasi nel siero e nelle urine e di lipasi nel siero, test degli enzimi epatici e funzionalità renale. Il campione di urina raccolto dopo la procedura verrà utilizzato per valutare i livelli di amilasi. Altri 20 ml di campioni di sangue saranno inviati al Dipartimento di Fisiologia e Immunologia, Facoltà di Medicina dove verranno eseguite le analisi immunologiche. Tutti i pazienti sottoposti a ERCP saranno divisi in due gruppi. Il primo gruppo (gruppo PEP) sarà composto da pazienti che hanno sviluppato pancreatite acuta a seguito di ERCP. Dopo la conferma clinica e di laboratorio della pancreatite acuta secondo le linee guida della Società Europea di Endoscopia Gastrointestinale (ESGE) per la pancreatite post-ERCP, sarà ulteriormente monitorato durante il ricovero per la valutazione della gravità della malattia. La gravità della malattia sarà valutata secondo i criteri di Cotton per la gravità della pancreatite post-ERCP. Gruppo di pazienti sottoposti a ERCP ma che non hanno sviluppato pancreatite acuta entro 24 ore dalla procedura, secondo le linee guida ESGE verrà utilizzato come gruppo di controllo (gruppo non PEP).

A tutti i pazienti con pancreatite acuta secondo i criteri di Atlanta ammessi al Pronto Soccorso verranno prelevati 30 ml di sangue venoso periferico eparinizzato e campione di urina 24 ore dopo l'inizio dei sintomi clinici (dolore addominale superiore che spesso si irradia fino alla schiena). 10 mL di campioni di sangue raccolti saranno esaminati presso il Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Centro Clinico Ospedaliero per i seguenti parametri: valori di amilasi nel siero e nelle urine e lipasi nel siero, test degli enzimi epatici e funzionalità renale. Altri 20 ml di campioni di sangue saranno inviati al Dipartimento di Fisiologia e Immunologia, Facoltà di Medicina dove verranno eseguite le analisi immunologiche. Questo gruppo di pazienti sarà ulteriormente monitorato durante il ricovero per la valutazione della gravità della malattia. La gravità della malattia sarà valutata secondo i criteri di Atlanta.

METODI E MATERIALI

Parametri di laboratorio

Per ogni paziente incluso nello studio verranno eseguite analisi del sangue e delle urine presso il Dipartimento di Medicina di Laboratorio, Centro Ospedaliero Clinico Rijeka. I test ematologici di base includeranno: emocromo totale - un conteggio del numero totale di globuli rossi, globuli bianchi e piastrine presenti nel sangue, valori di emoglobina ed ematocrito. L'analisi biochimica del siero del sangue includerà: valori di amilasi e lipasi nel siero, sodio, potassio, glucosio, enzimi epatici (aspartato aminotransferasi (AST), alanina aminotransferasi (ALT), Gama-glutamiltransferasi (GGT), fosfatasi alcalina (ALP) ) bilirubina diretta e indiretta, funzione renale (urea sierica e creatinina, filtrazione glomerulare stimata (eGFR)), proteina C-reattiva e stato acido-base del sangue arterioso.

Metodi immunologici

Per ogni paziente incluso nello studio l'analisi immunologica dei campioni di sangue (24 ore dopo la procedura o l'insorgenza dei sintomi) sarà eseguita presso il Dipartimento di Fisiologia e Immunologia, Facoltà di Medicina di Rijeka, Croazia.

Isolamento di cellule mononucleate di sangue periferico Venti millilitri di sangue periferico saranno acquisiti in Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY), sovrapposti a Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norvegia) e centrifugati (20 min a 600 g). Dopo la centrifugazione, le cellule dall'interfaccia saranno raccolte e lavate due volte nel mezzo 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Auckland, NZ) e utilizzate immediatamente per ulteriori procedure sperimentali. La vitalità delle cellule era >95% sarà valutata con ioduro di propidio 0,5 mg/ml/106 cellule (Sigma-Aldrich Chemie) e un citometro a flusso (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, USA)

Rilevamento della superficie cellulare Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) saranno colorate per 30 minuti a 40 gradi Celsius con diverse combinazioni di anticorpo monoclonale ficoeritrina (PE) - cianina (Cy) anti-cluster of differenziation (CD) 3 (anticorpo murino (mAb ), immunoglobulina G 1 (IgG1)), anti-cluster di differenziazione coniugato con PE (CD) 56 mAb (topo B159, IgG1) e anti-natural-killer gruppo 2 coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC), membro D (NKG2D) mAb (5C6). Gli anticorpi murini coniugati FITC-, PE- e PE-Cy saranno utilizzati per impostare i controlli negativi per ogni classe di anticorpo utilizzata.

I campioni di cellule colorate saranno analizzati mediante citometria a flusso utilizzando il citometro a flusso FACSCalibur (Becton Dickinson & Co, San Jose, USA).

Rilevamento della citochina Interleuchina (IL)-1 beta (β) e della proteina da shock termico (HSP) 70, 27.

Per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di IL-1 β umana nel plasma, verrà utilizzato il kit Human IL-1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Per la determinazione quantitativa delle proteine ​​da shock termico (HSP) 70 e 27 nel plasma, verranno utilizzati i kit HSP 70 ELISA ad alta sensibilità e HSP 27 ELISA.

Rilevazione di pentraxina 3 (PTX 3) e procalcitonina Per la determinazione quantitativa delle concentrazioni di pentraxina 3 umana (PTX) e procalcitonina nel plasma verrà utilizzato un kit ELISA specifico.