Pancreatite aguda induzida por CPRE e não induzida por CPRE: duas entidades clínicas e imunológicas distintas?

PROTOCOLO:

Todos os pacientes com indicação de colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE) serão preparados para CPRE no seguinte protocolo: serão orientados a não se alimentar 4 a 6 horas antes do procedimento. Imediatamente antes do procedimento, serão administrados supositórios de Diclofenaco Sódico 100 mg. Uma hora antes do procedimento, 10 mL de amostra de sangue e urina serão coletados e analisados ​​em instalações laboratoriais incorporadas ao University Hospital Center Rijeka para os seguintes parâmetros: valores de amilase no soro e na urina e lipase no soro, testes de enzimas hepáticas e função renal. 4-6 horas após a realização da CPRE, 10 mL de amostra de sangue serão coletados e analisados ​​em instalações laboratoriais incorporadas ao University Hospital Center Rijeka para os seguintes parâmetros: valores de amilase no soro e na urina e lipase no soro, testes de enzimas hepáticas e função renal .

24 horas após o procedimento todos os pacientes receberão 30 ml de sangue venoso periférico heparinizado e amostra de urina. 10 mL serão examinados no Departamento de Medicina Laboratorial do Centro Hospitalar Clínico para os seguintes parâmetros: valores de amilase no soro e na urina e lipase no soro, testes de enzimas hepáticas e função renal. A amostra de urina coletada após o procedimento será utilizada para avaliar os níveis de amilase. Outros 20 mL de amostras de sangue serão enviados ao Departamento de Fisiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina, onde serão realizadas análises imunológicas. Todos os pacientes submetidos à CPRE serão divididos em dois grupos. O primeiro grupo (grupo PPE) será composto por pacientes que desenvolveram pancreatite aguda após CPRE. Após a confirmação clínica e laboratorial de pancreatite aguda de acordo com as diretrizes da Sociedade Europeia de Endoscopia Gastrointestinal (ESGE) para pancreatite pós-CPRE, será monitorado ainda durante a internação para avaliação da gravidade da doença. A gravidade da doença será avaliada de acordo com os critérios de Cotton para a gravidade da pancreatite pós-CPRE. Grupo de pacientes que realizaram CPRE, mas não desenvolveram pancreatite aguda dentro de 24 horas após o procedimento, de acordo com as diretrizes da ESGE, será usado como grupo controle (grupo não-PEP).

Todos os pacientes com pancreatite aguda de acordo com os critérios de Atlanta admitidos no Departamento de Emergência receberão 30 ml de sangue venoso periférico heparinizado e amostra de urina 24 horas após o início dos sintomas clínicos (dor abdominal superior frequentemente irradiando para as costas). 10 mL de amostras de sangue coletadas serão examinadas no Departamento de Medicina Laboratorial do Centro Hospitalar Clínico para os seguintes parâmetros: valores de amilase no soro e na urina e lipase no soro, testes de enzimas hepáticas e função renal. Outros 20 mL de amostras de sangue serão enviados ao Departamento de Fisiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina, onde serão realizadas análises imunológicas. Esse grupo de pacientes será ainda acompanhado durante a internação para avaliação da gravidade da doença. A gravidade da doença será avaliada de acordo com os critérios de Atlanta.

MÉTODOS E MATERIAIS

Parâmetros laboratoriais

Para cada paciente incluído no estudo, análises de sangue e urina serão realizadas no Departamento de Medicina Laboratorial do Centro Hospitalar Clínico de Rijeka. Os testes básicos de hematologia incluirão: hemograma total - uma contagem do número total de glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas presentes no sangue, valores de hemoglobina e hematócrito. A análise bioquímica do soro sanguíneo incluirá: valores de amilase e lipase no soro, sódio, potássio, glicose, enzimas hepáticas (aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), Gama-glutamil transferase (GGT), fosfatase alcalina (ALP) ) bilirrubina direta e indireta, função renal (ureia e creatinina séricas, filtração glomerular estimada (eGFR)), proteína C-reativa e estado ácido-básico do sangue arterial.

Métodos imunológicos

Para cada paciente incluído no estudo, a análise imunológica de amostras de sangue (24 horas após o procedimento ou início dos sintomas) será realizada no Departamento de Fisiologia e Imunologia da Faculdade de Medicina de Rijeka, Croácia.

Isolamento de células mononucleares do sangue periférico Vinte mililitros de sangue periférico serão adquiridos em Vacutainer (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY), sobrepostos em Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega) e centrifugados (20 min a 600 g). Após a centrifugação, as células da interface serão coletadas e lavadas duas vezes em meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Auckland, NZ) e utilizadas imediatamente para posterior procedimento experimental. A viabilidade das células foi >95% será avaliada com iodeto de propídio 0,5 mg/ml/106 células (Sigma-Aldrich Chemie) e um citômetro de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, EUA)

Detecção da superfície celular Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) serão coradas por 30 min a 40 graus Celsius com diferentes combinações de Ficoeritrina (PE) - Cianina (Cy) anti-cluster de diferenciação (CD) 3 anticorpo monoclonal (anticorpo de camundongo (mAb ), Imunoglobulina G 1 (IgG1)), anticluster de diferenciação (CD) 56 mAb conjugado com PE (camundongo B159, IgG1) e grupo anti-natural killer conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) 2, membro D (NKG2D) mAb (5C6). Anticorpos de isotipo de camundongo conjugados com FITC, PE e PE-Cy serão usados ​​para definir controles negativos para cada classe de anticorpo usada.

As amostras de células coradas serão analisadas por citometria de fluxo usando o citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson & Co, San Jose, EUA).

Detecção de citocina Interleucina (IL)-1 beta (β) e proteína de choque térmico (HSP) 70, 27.

Para a determinação quantitativa das concentrações plasmáticas de IL-1 β humana, será utilizado o Kit Human IL-1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Para a determinação quantitativa da proteína de choque térmico (HSP) 70 e 27 no plasma, serão utilizados os kits HSP 70 ELISA de alta sensibilidade e HSP 27 ELISA.

Detecção de pentraxina 3 (PTX 3) e procalcitonina Para a determinação quantitativa das concentrações de pentraxina 3 humana (PTX) e procalcitonina em plasma específico ELISA Kit será usado.