Akutní pankreatitida indukovaná ERCP a neindukovaná ERCP: dvě odlišné klinické a imunologické entity?

PROTOKOL:

Všichni pacienti s indikací k endoskopické retrográdní cholangiopankreatikografii (ERCP) budou připraveni na ERCP podle následujícího protokolu: 4 až 6 hodin před výkonem budou instruováni, aby nejedli. Bezprostředně před výkonem jim budou podány čípky Diclophenac Sodium 100 mg. Hodinu před výkonem bude odebráno 10 ml vzorku krve a moči, které budou v laboratorních prostorách FN Rijeka analyzovány na následující parametry: hodnoty amylázy v séru a moči a lipázy v séru, jaterní enzymatické testy a funkce ledvin. 4-6 hodin po provedení ERCP bude odebrán 10 ml krevního vzorku, který bude analyzován v laboratorních prostorách Fakultní nemocnice v centru Rijeka na následující parametry: hodnoty amylázy v séru a moči a lipázy v séru, jaterní enzymatické testy a funkce ledvin .

24 hodin po výkonu bude všem pacientům odebráno 30 ml heparinizované periferní žilní krve a vzorku moči. 10 ml bude vyšetřeno na Oddělení laboratorní medicíny, Clinical Hospital Center pro následující parametry: hodnoty amylázy v séru a moči a lipázy v séru, jaterní enzymatické testy a funkce ledvin. Vzorek moči odebraný po výkonu bude použit k vyhodnocení hladin amylázy. Dalších 20 ml vzorků krve bude zasláno na Ústav fyziologie a imunologie Lékařské fakulty, kde bude provedena imunologická analýza. Všichni pacienti, kteří podstoupili ERCP, budou rozděleni do dvou skupin. První skupina (skupina PEP) bude tvořena pacienty, u kterých se po ERCP rozvinula akutní pankreatitida. Po klinickém a laboratorním potvrzení akutní pankreatitidy podle pokynů Evropské společnosti pro gastrointestinální endoskopii (ESGE) pro post-ERCP pankreatitidu bude dále sledována během hospitalizace pro hodnocení závažnosti onemocnění. Závažnost onemocnění bude hodnocena podle Cottonových kritérií pro závažnost post-ERCP pankreatitidy. Skupina pacientů, kteří podstoupili ERCP, ale neprojevila se u nich akutní pankreatitida do 24 hodin po výkonu, bude dle doporučení ESGE použita jako kontrolní skupina (non-PEP skupina).

Všem pacientům s akutní pankreatitidou podle atlantských kritérií přijatým prostřednictvím urgentního příjmu bude odebráno 30 ml heparinizované periferní žilní krve a vzorku moči 24 hodin po nástupu klinických příznaků (bolest v horní části břicha často vyzařující do zad). 10 ml odebraných krevních vzorků bude vyšetřeno na Klinice laboratorního lékařství Klinického nemocničního centra pro následující parametry: hodnoty amylázy v séru a moči a lipázy v séru, jaterní enzymatické testy a funkce ledvin. Dalších 20 ml vzorků krve bude zasláno na Ústav fyziologie a imunologie Lékařské fakulty, kde bude provedena imunologická analýza. Tato skupina pacientů bude dále sledována během hospitalizace pro hodnocení závažnosti onemocnění. Závažnost onemocnění bude hodnocena podle kritérií Atlanty.

METODY A MATERIÁLY

Laboratorní parametry

U každého pacienta zařazeného do studie bude analýza krve a moči provedena na Oddělení laboratorní medicíny, Clinical Hospital Center Rijeka. Základní hematologická vyšetření budou zahrnovat: celkový krevní obraz - počet celkového počtu červených krvinek, bílých krvinek a krevních destiček přítomných v krvi, hodnoty hemoglobinu a hematokritu. Biochemická analýza krevního séra bude zahrnovat: hodnoty amylázy a lipázy v séru, sodíku, draslíku, glukózy, jaterních enzymů (aspartátaminotransferáza (AST), alaninaminotransferáza (ALT), gama-glutamyltransferáza (GGT), alkalická fosfatáza (ALP) ) přímý a nepřímý bilirubin, funkce ledvin (sérová urea a kreatinin, odhadovaná glomerulární filtrace (eGFR)), C-reaktivní protein a acidobazický stav arteriální krve.

Imunologické metody

U každého pacienta zařazeného do studie bude na Ústavu fyziologie a imunologie Lékařské fakulty v Rijece v Chorvatsku proveden imunologický rozbor vzorků krve (24 hodin po výkonu nebo nástupu příznaků).

Izolace mononukleárních buněk periferní krve Dvacet mililitrů periferní krve bude získáno ve Vacutaineru (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NY), naneseno na Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norsko) a odstředěno (20 minut při 600 g). Po centrifugaci budou buňky z rozhraní shromážděny a dvakrát promyty v médiu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Auckland, NZ) a okamžitě použity pro další experimentální postup. Životaschopnost buněk byla >95 % bude hodnocena pomocí propidium jodidu 0,5 mg/ml/106 buněk (Sigma-Aldrich Chemie) a průtokového cytometru (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, USA)

Detekce buněčného povrchu Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) budou barveny po dobu 30 minut při 40 stupních Celsia různými kombinacemi fykoerythrin (PE) - Cyanin (Cy) anti-shluk diferenciace (CD) 3 monoklonální protilátka (myší protilátka (mAb) ), imunoglobulin G 1 (IgG1)), PE-konjugovaný anti-shluk diferenciace (CD)56 mAb (myší B159, IgG1) a fluorescein isothiokyanát (FITC) konjugovaný anti-natural-killer skupina 2, člen D (NKG2D) mAb (5C6). FITC-, PE- a PE-Cy konjugované myší izotypově odpovídající protilátky budou použity k nastavení negativních kontrol pro každou třídu použitých protilátek.

Vzorky obarvených buněk budou analyzovány průtokovou cytometrií pomocí průtokového cytometru FACSCalibur (Becton Dickinson & Co, San Jose, USA).

Detekce cytokinu Interleukin (IL)-1 beta (β) a proteinu tepelného šoku (HSP) 70, 27.

Pro kvantitativní stanovení koncentrací lidského IL-1 β v plazmě bude použita souprava Human IL-1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Pro kvantitativní stanovení proteinu tepelného šoku (HSP) 70 a 27 v plazmě bude použita souprava HSP 70 High sensitive ELISA Kit a souprava HSP 27 ELISA.

Detekce pentraxinu 3 (PTX 3) a prokalcitoninu Pro kvantitativní stanovení koncentrací lidského pentraxinu 3 (PTX) a prokalcitoninu v plazmě specifické soupravě ELISA bude použita.