Denosumab och manlig infertilitet: en RCT

INTRODUKTION

Infertilitet är ett allvarligt problem som uppskattas drabba 7-26 % av alla par globalt (1;2). Ungefär 9 % av alla nyfödda föddes med hjälp av assisterad befruktning 2013 i Danmark (Danish Fertility Society). Försämrad spermakvalitet är orsaken eller bidragande faktorn i nästan 50 % av alla fall av infertilitet (3;4). Idag finns det inga behandlingar som kan förbättra spermakvaliteten hos de flesta infertila män. Istället behandlas de allra flesta infertila par med assisterad reproduktionsteknik (ART) oberoende av etiologin (maternal/faderlig) som orsakar infertiliteten (3;5-8). Behandlingsvalet sträcker sig från milda intrauterina inseminationer (IUI) till mer invasiv in vitro fertilisering (IVF) eller intracytoplasmatisk spermieinjektion (ICSI). ART är framgångsrik för mer än 70 % av alla par. ART är dock mycket dyrt och förknippat med moderns biverkningar på grund av den invasiva metodiken och behovet av hormonbehandling, ofta under flera månader (9-11). Infertilitet är också en ekonomisk börda för samhället på grund av kostnaderna för ART för att upprätthålla en acceptabel årlig födelsetal.

Fertilitetspotentialen bestäms av spermakvaliteten är etablerad redan som foster (12). Om testiklarna inte utvecklas normalt, kommer nedsatt spermakvalitet i vuxen ålder att bli resultatet av nedsatt Sertoli-cellfunktion. Hittills har det knappt undersökts om ingrepp under vuxen ålder kan förbättra spermakvaliteten.

Våra nyligen genomförda studier med användning av både mänskliga testiklar och D-vitamin-utslagsmöss visade att den D-vitaminreglerade benfaktorn RANKL uttrycks i testiklarna (13;14). Detta är ett nytt fynd, eftersom RANKL hittills endast har varit känt för att påverka benhomeostas och i viss utsträckning påverka immunförsvaret, inflammation och amning (15;16). I skelettet uttrycks RANKL i osteoblaster och binder till sin specifika receptor RANK i osteoklaster för att inducera osteoklastogenes och benresorption (17). Denna aktivering kontrolleras av osteoprotegerin (OPG), som binder till liganddomänen av RANKL och därmed hämmar RANK-aktivering och osteoklastogenes, vilket i slutändan minskar benresorptionen (18). Denna kunskap har använts för utveckling av ett OPG-analogt läkemedel, en rekombinant human monoklonal IGg2-antikropp Denosumab (Prolia by Amgen), som hämmar RANKL och därmed benresorption och är indicerad för användning vid både osteoporos och benmetastaser (19;20) . Prolia har i flera kliniska studier visat sig vara säker och är godkänd som behandling för osteoporos hos både män och kvinnor (21-24). Nyare data indikerar att RANKL/OPG kan vara involverad i reglering av pankreasfunktion, insulin- och glukagonproduktion, vilket stöder en möjlig indirekt effekt på reproduktion genom ben-pankreas-gonadala axeln.

STUDIENS SYFTE

Att bestämma betydelsen av systemisk RANKL-hämning för manlig reproduktion genom att undersöka om Denosumab (Prolia) kan öka spermakvaliteten och särskilt att identifiera den grupp män som kommer att dra nytta av behandlingen.

DESIGN

Enkelcenter, prospektiv randomiserad dubbelblind* klinisk kontrollerad intervention.

Patienter och metoder:

95 infertila män, i övrigt friska, kommer att rekryteras bland män som remitteras till utredning för infertilitet på polikliniken på Dpt. för tillväxt och reproduktion, Rigshopitalet. Varken att välja att delta eller att tacka nej kommer att påverka den fortsatta poliklinikbehandlingen.

De 95 deltagarna är slumpmässigt fördelade på att ta emot antingen

• Denosumab s.c. injektion 60 mg x1, eller
• Placebo, natriumklorid s.c. injektion x 1

Alla deltagare levererar spermaprover, blodprover och får DXA-skanning utförd före och efter intervention. Alla får tillskott med vitamin D och kalcium för att undvika hypokalcemi, en känd, tillfällig biverkning till Denosumab.

*dubbelblindade studier kräver att placebo och aktiv substans är identiska. Placebo kan endast erhållas från Amgen och vi kunde inte ta emot eller köpa placebo. Istället kommer studien att vara dubbelblindad för patient, läkare och alla som deltar i datahantering och analyser - endast en sjuksköterska som ger läkemedlet kommer att avblindas. Hon kommer att veta om hon injicerar aktiv substans eller placebo.

Inklusionskriterier

• Män > 18 år remitterade pga infertilitet i behov av vidare utredning med
• Spermiekoncentration ≥ 0,05 miljoner/ml.
• Spermiekoncentration <15 miljoner/ml eller
• <40 % rörliga spermier (ABC) eller
• <4 % morfologiskt normala spermier (stränga kriterier)

Exklusions kriterier

• Män med kroniska sjukdomar (diabetes mellitus, sköldkörtelsjukdom, endokrina sjukdomar som kräver behandling, maligna sjukdomar eller sjukdomar som är kända för att påverkas av- eller störa vitamin D-tillskott (granulomatösa sjukdomar som sarkoidos, tuberkulos, wegeners, vaskulit samt inflammatoriska tarmsjukdomar) t.ex. chrons sjukdom eller ulcerös kolit etc.).
• Män med aktiv eller tidigare malign sjukdom
• Alla fall med indikation för testikelbiopsi,
• Totalt kalcium < 2,14 mmol/l
• 25-OH Vitamin D < 25 nmol/L
• Dålig tandstatus eller tandimplantat
• Män med obstruktiv oligospermi eller som har vasektomerats
• Seruminhibin B < 30 pg/ml
• Onormal karyotyp
• Patienter som utövar överdriven träning

PROVSTORLEK BERÄKNING OCH STATISTIK

Med en testnivå på 5 % (signifikansnivå), en styrka på 80 % och 40 män i varje grupp kommer vi att kunna upptäcka en förändring i det totala antalet rörliga spermier på 75 % och en förändring i spermiekoncentrationen (indexerad till baslinjevärde) på 25 %.

Vi räknar med att ta med totalt 95 män, för att ta hänsyn till möjligheten till avhopp. Detta motsvarar ett avhopp på 10 %, om andelen är lägre är chansen att upptäcka en signifikant skillnad över 80 %.

Eftersom vi förväntar oss att 50 % av alla infertila män i öppenvården ska uppfylla inklusionskriterier och 50 % av dessa samtycker till deltagande, räknar vi med screening av totalt 380 män.

BIOSTATISTISK ANALYS

Alla analyser kommer att utföras enligt Good Clinical Practice-riktlinjer och de primära analyserna i intention-to-treat-populationen, som inkluderade alla patienter som genomgick randomisering och fick den första dosen av medicinen dag 1. Vi kommer att analysera data på 2 sätt. Den primära analysen kommer att fortsätta enligt den randomiserade gruppuppgiften. Den sekundära analysen kommer att baseras på att stratifiera männen enligt subgruppsanalyser i förhållande till de fördefinierade primära och sekundära effektmåtten.

De primära slutpunkterna för detta protokoll kommer att vara förändringar i spermieproduktionen utvärderade av: totala rörliga spermier (106), totala progressiva rörliga spermier (106), totala spermier (106) eller spermiekoncentration (106/ml). På grund av den låga provstorleken och den stora intraindividuella variationen i spermieproduktion kommer primära effektmått också att utvärderas efter normalisering till medelmedelnivån före interventionen. Baserat på den första interventionen uppskattas 60 % av männen dra nytta av behandlingen och denna studie är utformad för att avgöra om serum OPG, RANKL eller fosfat kan användas för att identifiera män som kommer att dra nytta av behandlingen. Användningen av dessa specificerade effektmått kommer att vara användbar för att bestämma effektiviteten. Flera sekundära effektmått finns men för den inledande undersökningen kommer fokus att ligga på: Spermier DFI, morfologi, motilitet, spermavolym, graviditetsfrekvens, inhibin B, vitamin D och kalciumhomeostas. Försökspersoner som avslutar deltagandet efter besök vid 80 dagar men före besöksdag 160 kommer att inkluderas för dataanalys fram till dag 80. Män som bara levererar ett spermaprov eller som saknar data vid något besök kommer fortfarande att inkluderas i analysen. Män med feber upp till 3 månader före spermaanalys kommer att betraktas som en potentiell konfounder. Dessa värden kommer sedan att föras vidare för analyser. En signifikansnivå på 5 % används. För de primära analyserna beräknas Bonferroni-Holm p-värdeskorrektion dessutom. För den sekundära analysen används ingen multipla testkorrigering. Istället diskuteras resultaten med tanke på de många testsituationerna.

1. Analyser mellan placebo och aktiv substans: Det första steget kommer att vara att jämföra förändringarna i primära resultat mellan de två grupperna. Denna analys kommer att visa om det finns en signifikant skillnad mellan grupperna. För alla effektmått uppmätta vid baslinjen och dag 80 och 160 kommer parade t-test att användas för att bedöma om det finns en signifikant skillnad mellan grupperna och avgöra om medelförändringen inom varje grupp skiljer sig signifikant från noll. I båda fallen kommer data att omvandlas efter behov för att möta modellens antaganden. På grund av antagna skillnader i abstinenstiden kommer samma analyser att utföras efter uteslutning av män med varaktighet <48 timmar före eller efter 80 dagars behandling. Efteråt kommer den initiala analysen att utföras genom att använda multipel regression med relevanta konfounders som säsong, BMI, rökning, ålder, abstinens varaktighet, tid från utlösning till motilitetsbedömning, feber etc. för att se om detta förändrar resultaten. För uppmätta resultat som inte kan jämföras med t-test eller andra parametriska test på dag 1, dag 80 och dag 160, kommer grupper att jämföras med hjälp av icke-parametriska tester som Wilcoxon Mann-Whitney test. För binärt utfall kommer data att jämföras mellan de två grupperna med hjälp av villkorad logistisk regressionsanalys med justering för relevanta konfounders (definierad som signifikant p<0,05 associerad). För utfall som mäts upprepade gånger kommer detta att innebära att man jämför de uppskattade lutningarna, eller förändringshastigheterna, för varje utfall mellan grupperna. Blandade modeller tillåter att korrelationen mellan de upprepade observationerna baslinje-dag 1-dag 80-dag 160 från varje man på lämpligt sätt inkorporeras i parameteruppskattning. Variabler för spermieproduktion kommer att normaliseras till baslinjenivåer för att undvika den enorma interindividuella variationen i spermieantal och spermiekoncentration
2. Subgruppsanalys kommer att vara väsentlig i denna studie eftersom vi förväntar oss att cirka 60 % av männen kommer att dra nytta av behandling med Denosumab. Analyser efter stratifiering i undergrupper kommer därför att användas för att identifiera en markör för att välja ut de män som kommer att dra nytta av behandlingen. Försökspersonerna kommer att grupperas efter deras serum OPG och/eller RANKL, RANKL/OPG-förhållande, deras DNA-fragmenteringsindex före starten av interventionen. Efteråt kommer andra potentiella prediktorer för behandlingssvar att testas såsom BMI, S-kalcium, s-fosfat, BMD, spermakvalitet, Inhibin b, FSH på dag 80 och dag 160. För serum OPG kan sådan stratifiering vara i två grupper separerade med till exempel 3 pg/ml eller tre grupper, <3, 3-4 och över 4 pg/ml. Likaså för RANKL och RANKL/OPG-förhållande och för DNA-fragmentering-Index-stratifiering kan också vara i två grupper separerade av t.ex. DFI på 40 %. Undergruppsanalyserna kommer att vara i enlighet med normal klinisk praxis och stratifiering i lämpliga grupper enligt de kliniska eller högsta/lägsta grupperna.

SCREENING OCH TIDSKURS

Studien kommer att påbörjas i januari 2017 och avslutas när den sista personen har inkluderats senast januari 2021.

RESULTATMÄTNINGAR

Slutpunkter:

Primära slutpunkter

• Förändring i spermaproduktionen (total rörliga spermier, progressiva rörliga spermier, spermieantal, spermiekoncentration)

Sekundära slutpunkter

• Förändring i spermakvalitet (-motilitet, -morfologi, spermavolym)
• Förändring i DNA-fragmenteringshastighet (DFI) i spermier
• Förändring i serum Inhibin-B
• Förändringar i serumnivåer av reproduktionshormoner (FSH, LH, AMH, testosteron, östradiol och SHBG)
• Förändring i serumprolaktinnivån
• Förändring i fasteglukosnivån
• Förändring i fastininsulinnivån
• Förändring i c-peptid
• Förändring i HbA1c
• Förändring i lipidprofil
• Förändring i bentäthet utvärderad av DXA.
• Förändring i serumnivån av inaktivt vitamin D, 1,25(OH)2D3, 25-OHD3, 24,25(OH)2D3, PTH, alkaliskt fosfatas, joniserat kalcium, fosfat, FGF23, Klotho, osteokalcin, matrix gla, osteopontin, kalcitonin, pnp, prokollagen III, OPG, RANKL, Sclerostin samt annan benmarkör.
• Ändring i val av assisterad befruktningsteknik samt tänkta graviditeter
• Förändring i spontan befruktningsfrekvens
• Förändring av levande födelsetal
• Förändring i antal spermier som uttrycker RANKL
• Förändring i sperma pH, HCO3-, kalcium, zink, fosfat, RANKL, RANK, OPG, FGF23, Klotho, osteokalcin, osteopontin. VDB, 24,25OH2
• Skillnad i infektionsfrekvens i de två grupperna

INSTÄLLNING, VETENSKAPLIG PLAN OCH REKRYTERING

Deltagarna kommer att inkluderas bland män som remitteras till avdelningen för tillväxt och reproduktion (avdelningen för GR), Rigshospitalet (RH) för utvärdering av manlig infertilitet

Detta är en prospektiv, dubbelblind, tvåarmad randomiserad kontrollerad studie. Interventionsgrupp: Varje man kommer att få Denosumab 60 mg x 1 sc endast på dag 1 Grupp som får placebo: Kommer att följa samma händelsekedja, även om Denosumab kommer att ersättas med koksaltlösning

Alla män kommer att erbjudas samma D-vitamin- och kalciumtillskott med början innan behandlingen påbörjas med Denosumab eller placebo: D-vitamin 15 mikrogram och kalcium 400 mg en gång dagligen.

DELTAGARE

Screening av ~500 infertila män kommer att utföras. Utredarna antar att ~300 män kommer att uteslutas och ~100 män inte vill delta. Därmed kommer 95 män att ingå i studien och hälften randomiseras till aktiv behandling. Utredarna förväntar sig ett litet avhopp (<5) på grund av hög motivation och inga negativa effekter.

ANALYS OCH INTERVENTION

Reproduktionshormoner och sperma kommer att analyseras på avd. av GR, Rigshospitalet.

ETIK OCH BIVERKNINGAR

Alla patienter kommer att ha fyllt i sin utredning innan de bjuds in till studien. De kommer att informeras om potentiella negativa effekter, och de kan lämna rättegången när som helst utan några konsekvenser.

Denosumab har bevisats vara säkert i flera randomiserade studier och är redan godkänt av både FDA och EMA. Alla biverkningar kommer att övervakas noggrant, registreras och vid antingen oväntad frekvens av biverkningar eller oväntade kliniska komplikationer kommer det att publiceras.

Baserat på tidigare fertilitetsstudier på vår avdelning förväntar vi oss att en stor del av de utemottagningspatienter vill delta. Enligt vår uppfattning är den skisserade studien etisk sund och vi anser att för att generera framtida rekommendationer är randomiserade kliniska prövningar nödvändiga.

PUBLICERING AV RESULTAT

Alla resultat, positiva eller negativa, kommer att skickas till peer reviewed vetenskapliga tidskrifter. Data kommer successivt att erhållas och överföras till en statistisk databas.