Denosumab e infertilità maschile: un RCT

INTRODUZIONE

L'infertilità è un problema serio che si stima colpisca il 7-26% di tutte le coppie a livello globale (1;2). Circa il 9% di tutti i neonati è stato concepito con tecniche di riproduzione assistita nel 2013 in Danimarca (Danish Fertility Society). La compromissione della qualità del seme è il fattore causale o contribuente in quasi il 50% di tutti i casi di infertilità (3;4). Oggi non esistono trattamenti che possano migliorare la qualità del seme della maggior parte degli uomini infertili. Invece, la stragrande maggioranza delle coppie infertili viene trattata con tecniche di riproduzione assistita (ART) indipendentemente dall'eziologia (materna/paterna) che causa l'infertilità (3;5-8). La scelta terapeutica varia da una lieve inseminazione intrauterina (IUI) a una più invasiva fecondazione in vitro (IVF) o iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI). ART ha successo per oltre il 70% di tutte le coppie. Tuttavia, l'ART è molto costosa e associata a effetti collaterali materni a causa della metodologia invasiva e della necessità di trattamento ormonale, spesso per diversi mesi (9-11). L'infertilità è anche un onere finanziario per la società a causa dei costi dell'ART per mantenere un tasso di natalità annuale accettabile.

Il potenziale di fertilità determinato dalla qualità del seme è stabilito già come feto (12). Nel caso in cui i testicoli non si sviluppino normalmente, la ridotta qualità dello sperma in età adulta sarà il risultato di una ridotta funzionalità delle cellule di Sertoli. Fino ad oggi è stato appena studiato se l'intervento durante l'età adulta possa migliorare la qualità del seme.

I nostri recenti studi che hanno utilizzato sia testicoli umani che topi knock-out per il recettore della vitamina D hanno rivelato che il fattore osseo regolato dalla vitamina D RANKL è espresso nel testicolo (13;14). Questa è una nuova scoperta, perché fino ad ora si sapeva che RANKL influenza solo l'omeostasi ossea e in una certa misura influenza il sistema immunitario, l'infiammazione e l'allattamento (15;16). Nello scheletro RANKL è espresso negli osteoblasti e si lega al suo specifico recettore RANK negli osteoclasti per indurre osteoclastogenesi e riassorbimento osseo (17). Questa attivazione è controllata dall'osteoprotegerina (OPG), che si lega al dominio del ligando di RANKL e quindi inibisce l'attivazione di RANK e l'osteoclastogenesi, riducendo infine il riassorbimento osseo (18). Questa conoscenza è stata utilizzata nello sviluppo di un farmaco analogo all'OPG, un anticorpo monoclonale umano ricombinante IGg2 Denosumab (Prolia di Amgen), che inibisce il RANKL e quindi il riassorbimento osseo ed è indicato per l'uso sia nell'osteoporosi che nelle metastasi ossee (19;20) . Prolia ha dimostrato di essere sicuro in diversi studi clinici ed è approvato come trattamento per l'osteoporosi sia negli uomini che nelle donne (21-24). Dati più recenti indicano che RANKL/OPG può essere coinvolto nella regolazione della funzione pancreatica, della produzione di insulina e glucagone, il che supporta un possibile effetto indiretto sulla riproduzione attraverso l'asse osso-pancreatico-gonadico.

OBIETTIVO DI STUDIO

Determinare il significato dell'inibizione sistemica di RANKL per la riproduzione maschile, indagando se Denosumab (Prolia) può aumentare la qualità del seme e in particolare identificare il gruppo di uomini che trarranno beneficio dal trattamento.

PROGETTO

Singolo centro, intervento clinico controllato prospettico randomizzato in doppio cieco*.

Pazienti e metodi:

95 uomini infertili, altrimenti sani, saranno reclutati tra gli uomini sottoposti ad accertamento per infertilità presso l'ambulatorio del Dpt. di Crescita e Riproduzione, Rigshopitalet. Né la scelta di partecipare, né il rifiuto, influiranno su ulteriori trattamenti ambulatoriali.

I 95 partecipanti vengono assegnati in modo casuale a ricevere entrambi

• Denosumab s.c. iniezione 60 mg x1, o
• Placebo, cloruro di sodio s.c. iniezione x 1

Tutti i partecipanti consegnano campioni di sperma, campioni di sangue e fanno eseguire la scansione DXA prima e dopo l'intervento. Tutti ricevono supplementi con vitamina D e calcio per evitare l'ipocalcemia, un noto effetto collaterale temporaneo del Denosumab.

*gli studi in doppio cieco richiedono che il placebo e il principio attivo siano identici. Il placebo può essere ottenuto solo da Amgen e non siamo stati in grado di ricevere o acquistare il placebo. Invece lo studio sarà in doppio cieco per il paziente, i medici e tutti coloro che partecipano alla gestione e all'analisi dei dati - solo un infermiere che somministra il medicinale sarà aperto. Saprà se inietta sostanza attiva o placebo.

Criterio di inclusione

• Uomini > 18 anni di età segnalati a causa di infertilità che necessitano di ulteriori indagini con
• Concentrazione spermatica ≥ 0,05 mio./ml.
• Concentrazione spermatica <15 mio./ml o
• <40 % spermatozoi mobili (ABC) o
• <4 % spermatozoi morfologicamente normali (criteri rigorosi)

Criteri di esclusione

• Uomini con malattie croniche (diabete mellito, malattie della tiroide, malattie endocrine che richiedono un trattamento, malattie maligne o malattie note per essere colpite o interferire con integratori di vitamina D (malattie granulomatose come sarcoidosi, tubercolosi, wegener, vasculite e malattie infiammatorie intestinali per esempio. malattia di Chron o colite ulcerosa ecc.).
• Uomini con malattia maligna attiva o pregressa
• Qualsiasi caso con indicazione per biopsia testicolare,
• Calcio totale < 2,14 mmol/l
• 25-OH Vitamina D < 25 nmol/L
• Cattivo stato dentale o impianti dentali
• Uomini con oligospermia ostruttiva o vasectomizzati
• Inibina B sierica < 30 pg/ml
• Cariotipo anormale
• Pazienti che praticano esercizio fisico eccessivo

CALCOLO E STATISTICHE DELLA DIMENSIONE DEL CAMPIONE

Con un livello di test del 5% (livello di significatività), una potenza dell'80% e 40 uomini in ciascun gruppo saremo in grado di rilevare una variazione del numero totale di spermatozoi mobili del 75% e una variazione della concentrazione di spermatozoi (indice al valore basale) del 25%.

Prevediamo di includere un totale di 95 uomini, per tener conto della possibilità di abbandoni. Ciò corrisponde a un tasso di abbandono del 10%, nel caso in cui il tasso sia inferiore, le possibilità di rilevare una differenza significativa saranno superiori all'80%.

Poiché prevediamo che il 50% di tutti gli uomini infertili nella clinica ambulatoriale soddisfi i criteri di inclusione e il 50% di questi acconsenta alla partecipazione, prevediamo lo screening di 380 uomini in totale.

ANALISI BIOSTATISTICA

Tutte le analisi saranno eseguite secondo le linee guida di buona pratica clinica e le analisi primarie nella popolazione intent-to-treat, che includeva tutti i pazienti sottoposti a randomizzazione e che hanno ricevuto la prima dose di medicinale il giorno 1. Analizzeremo i dati in 2 modi. L'analisi primaria procederà in base all'assegnazione del gruppo randomizzato. L'analisi secondaria si baserà sulla stratificazione degli uomini secondo analisi di sottogruppi in relazione agli endpoint primari e secondari predefiniti.

Gli endpoint primari per questo protocollo saranno i cambiamenti nella produzione di spermatozoi valutati da: spermatozoi mobili totali (106), spermatozoi mobili progressivi totali (106), spermatozoi totali (106) o concentrazione di spermatozoi (106/ml). A causa della bassa dimensione del campione e della grande variazione intraindividuale nella produzione di spermatozoi, gli endpoint primari saranno valutati anche dopo la normalizzazione al livello medio medio prima dell'intervento. Sulla base del primo intervento stimato, il 60% degli uomini trarrà beneficio dal trattamento e questo studio è progettato per determinare se l'OPG sierico, il RANKL o il fosfato possono essere utilizzati per identificare gli uomini che beneficeranno del trattamento. L'uso di questi endpoint specificati sarà utile per determinare l'efficacia. Esistono molteplici endpoint secondari, ma per l'indagine iniziale ci si concentrerà su: sperma DFI, morfologia, motilità, volume del seme, tasso di gravidanza, inibina B, vitamina D e omeostasi del calcio. I soggetti che terminano la partecipazione dopo la visita a 80 giorni ma prima della visita al giorno 160 saranno inclusi per l'analisi dei dati fino al giorno 80. Gli uomini che consegnano un solo campione di sperma o hanno dati mancanti in ogni visita saranno comunque inclusi nell'analisi. Gli uomini con febbre fino a 3 mesi prima dell'analisi del seme saranno considerati un potenziale confondente. Tali valori verranno quindi riportati per le analisi. Viene utilizzato un livello di significatività del 5%. Per le analisi primarie viene calcolata in aggiunta la correzione del valore p di Bonferroni-Holm. Per l'analisi secondaria non viene utilizzata alcuna correzione del test multiplo. Invece i risultati sono discussi in considerazione delle molteplici situazioni di test.

1. Analisi tra placebo e sostanza attiva: il primo passo sarà confrontare i cambiamenti nei risultati primari tra i due gruppi. Questa analisi mostrerà se c'è una differenza significativa tra i gruppi. Per tutti gli endpoint misurati al basale e al giorno 80 e 160, verranno utilizzati t-test accoppiati per valutare se esiste una differenza significativa tra i gruppi e determinare se la variazione media all'interno di ciascun gruppo differisce significativamente da zero. In entrambi i casi, i dati verranno trasformati secondo necessità per soddisfare le ipotesi del modello. A causa delle presunte differenze nella durata dell'astinenza, le stesse analisi saranno condotte dopo l'esclusione degli uomini con durata <48 ore prima o dopo 80 giorni di trattamento. Successivamente, l'analisi iniziale sarà condotta utilizzando la regressione multipla con fattori confondenti rilevanti come stagione, indice di massa corporea, fumo, età, durata dell'astinenza, tempo dall'eiaculazione alla valutazione della motilità, febbre ecc. per vedere se questo cambia i risultati. Per i risultati misurati che non possono essere confrontati con il test t o altri test parametrici al giorno 1, giorno 80 e giorno 160, i gruppi verranno confrontati utilizzando test non parametrici come il test di Wilcoxon Mann-Whitney. Per l'esito binario i dati saranno confrontati tra i due gruppi mediante analisi di regressione logistica condizionale con aggiustamento per fattori confondenti rilevanti (definiti come significativamente p<0.05 associati). Per i risultati misurati ripetutamente, ciò comporterà il confronto delle pendenze stimate, o tassi di variazione, di ciascun risultato tra i gruppi. I modelli misti consentono di incorporare opportunamente nella stima dei parametri la correlazione tra le osservazioni ripetute al basale giorno 1 giorno 80 giorni 160 di ciascun uomo. Le variabili della produzione di sperma saranno normalizzate ai livelli basali per evitare l'enorme variazione interindividuale nella conta e nella concentrazione degli spermatozoi
2. L'analisi dei sottogruppi sarà essenziale in questo studio perché prevediamo che circa il 60% degli uomini beneficerà del trattamento con Denosumab. Le analisi dopo la stratificazione in sottogruppi saranno quindi utilizzate per identificare un marcatore per selezionare gli uomini che beneficeranno del trattamento I soggetti saranno raggruppati in base al loro OPG sierico e/o RANKL, rapporto RANKL/OPG, il loro indice di frammentazione del DNA prima della l'inizio dell'intervento. Successivamente verranno testati altri potenziali predittori della risposta al trattamento come BMI, S-calcio, s-fosfato, BMD, qualità del seme, Inhibin b, FSH al giorno 80 e al giorno 160. Per Serum OPG tale stratificazione potrebbe essere in due gruppi separati, ad esempio, da 3 pg/ml o tre gruppi, <3, 3-4 e oltre 4 pg/ml. Allo stesso modo per il rapporto RANKL e RANKL/OPG e per la stratificazione dell'indice di frammentazione del DNA potrebbe anche essere in due gruppi separati ad es. DFI del 40%. Le analisi dei sottogruppi saranno conformi alla normale pratica clinica e alla stratificazione in gruppi appropriati secondo i gruppi clinici o più alti/più bassi.

SCREENING E PERCORSO A TEMPO

Lo studio inizierà a gennaio 2017 e terminerà quando l'ultima persona sarà stata inclusa entro gennaio 2021.

MISURAZIONI DEI RISULTATI

Endpoint:

Endpoint primari

• Variazione della produzione di sperma (spermatozoi mobili totali, spermatozoi mobili progressivi, numero di spermatozoi, concentrazione di spermatozoi)

Endpoint secondari

• Cambiamento nella qualità del seme (-motilità, -morfologia, volume del seme)
• Variazione del tasso di frammentazione del DNA (DFI) nello sperma
• Cambiamento nel siero Inhibin-B
• Variazione dei livelli sierici degli ormoni riproduttivi (FSH, LH, AMH, testosterone, estradiolo e SHBG)
• Variazione del livello di prolattina sierica
• Variazione del livello di glucosio a digiuno
• Variazione del livello di insulina fastin
• Cambiamento nel peptide c
• Variazione dell'HbA1c
• Alterazione del profilo lipidico
• Variazione della densità minerale ossea valutata da DXA.
• Variazione del livello sierico di vitamina D inattiva, 1,25(OH)2D3, 25-OHD3, 24,25(OH)2D3, PTH, fosfatasi alcalina, calcio ionizzato, fosfato, FGF23, Klotho, osteocalcina, matrice gla, osteopontina, calcitonina, pnp, procollagene III, OPG, RANKL, sclerostina e altri marcatori ossei.
• Cambiamento nella scelta della tecnica di assistenza riproduttiva assistita e gravidanze concepite
• Variazione del tasso di concepimento spontaneo
• Variazione del tasso di natalità dal vivo
• Variazione del numero di spermatozoi che esprimono RANKL
• Variazione del pH del seme, HCO3-, calcio, zinco, fosfato, RANKL, RANK, OPG, FGF23, Klotho, osteocalcina, osteopontina. VDB, 24,25OH2
• Differenza nel tasso di infezione nei due gruppi

SETTING, PIANO SCIENTIFICO E ASSUNZIONE

I partecipanti saranno inclusi tra gli uomini indirizzati al Dipartimento di crescita e riproduzione (dipartimento di GR), Rigshospitalet (RH) per la valutazione dell'infertilità maschile

Questo è uno studio controllato randomizzato prospettico, in doppio cieco, a due bracci. Gruppo di intervento: ogni uomo riceverà Denosumab 60 mg x 1 sc solo al giorno 1 Gruppo che riceve il placebo: seguirà la stessa catena di eventi, sebbene Denosumab sarà sostituito con soluzione salina

A tutti gli uomini verrà offerta la stessa integrazione di vitamina D e calcio prima dell'inizio del trattamento con Denosumab o placebo: vitamina D 15 microgrammi e calcio 400 mg una volta al giorno.

PARTECIPANTI

Verrà eseguito lo screening di ~500 uomini infertili. Gli investigatori presumono che circa 300 uomini saranno esclusi e circa 100 uomini non desiderano partecipare. Pertanto, 95 uomini saranno inclusi nello studio e la metà sarà randomizzata al trattamento attivo. Gli investigatori si aspettano un piccolo abbandono (<5) a causa dell'elevata motivazione e dell'assenza di effetti avversi.

ANALISI E INTERVENTO

Gli ormoni riproduttivi e lo sperma saranno analizzati presso il dip. di GR, Rigshospitalet.

ETICA ED EFFETTI COLLATERALI

Tutti i pazienti avranno completato la loro indagine prima di essere invitati allo studio. Saranno informati dei potenziali effetti avversi e potranno abbandonare la sperimentazione in qualsiasi momento senza alcuna conseguenza.

Denosumab ha dimostrato di essere sicuro in diversi studi randomizzati ed è già approvato sia dalla FDA che dall'EMA. Tutti gli effetti collaterali saranno attentamente monitorati, registrati e in caso di frequenza imprevista di effetti avversi o complicanze cliniche impreviste verrà pubblicato.

Sulla base di precedenti studi sulla fertilità presso il nostro dipartimento, prevediamo che un'ampia percentuale di pazienti ambulatoriali desidererà partecipare. A nostro avviso lo studio delineato è etico e crediamo che per generare raccomandazioni future siano necessari studi clinici randomizzati.

PUBBLICAZIONE DEI RISULTATI

Tutti i risultati, positivi o negativi, saranno sottoposti a riviste scientifiche peer reviewed. I dati verranno successivamente acquisiti e trasferiti in un database statistico.