Denosumab en mannelijke onvruchtbaarheid: een RCT

INVOERING

Onvruchtbaarheid is een ernstig probleem dat naar schatting 7-26% van alle paren wereldwijd treft (1;2). In Denemarken (Danish Fertility Society) werd in 2013 ongeveer 9% van alle pasgeborenen verwekt met kunstmatige voortplantingstechnieken. Verminderde spermakwaliteit is de oorzakelijke of bijdragende factor in bijna 50% van alle gevallen van onvruchtbaarheid (3;4). Tegenwoordig bestaan ​​er geen behandelingen die de spermakwaliteit van de meeste onvruchtbare mannen kunnen verbeteren. In plaats daarvan wordt de overgrote meerderheid van onvruchtbare paren behandeld met kunstmatige voortplantingstechnieken (ART), ongeacht de etiologie (moeder/vader) die de onvruchtbaarheid veroorzaakt (3;5-8). De behandelingskeuze varieert van milde intra-uteriene inseminaties (IUI) tot meer invasieve in-vitrofertilisatie (IVF) of intracytoplasmatische sperma-injectie (ICSI). ART is succesvol voor meer dan 70% van alle koppels. ART is echter erg duur en gaat gepaard met maternale bijwerkingen vanwege de invasieve methodologie en de noodzaak van hormonale behandeling, vaak gedurende meerdere maanden (9-11). Onvruchtbaarheid is ook een financiële last voor de samenleving vanwege de kosten van ART om een ​​acceptabel jaarlijks geboortecijfer te behouden.

Vruchtbaarheidspotentieel bepaald door spermakwaliteit wordt al vastgesteld als foetus (12). Als de teelballen zich niet normaal ontwikkelen, is een verminderde spermakwaliteit op volwassen leeftijd het gevolg als gevolg van een verminderde werking van de Sertoli-cellen. Tot op heden is nauwelijks onderzocht of ingrijpen tijdens de volwassenheid de spermakwaliteit kan verbeteren.

Onze recente studies met zowel menselijke testis als vitamine D-receptor-knock-outmuizen onthulden dat de vitamine D-gereguleerde botfactor RANKL tot expressie wordt gebracht in de testis (13;14). Dit is een nieuwe bevinding, omdat tot nu toe alleen bekend was dat RANKL de bothomeostase beïnvloedt en tot op zekere hoogte het immuunsysteem, ontsteking en lactatie beïnvloedt (15;16). In het skelet wordt RANKL tot expressie gebracht in osteoblasten en bindt zich aan zijn specifieke receptor RANK in osteoclasten om osteoclastogenese en botresorptie te induceren (17). Deze activering wordt gecontroleerd door osteoprotegerine (OPG), dat bindt aan het liganddomein van RANKL en zo RANK-activering en osteoclastogenese remt, waardoor botresorptie uiteindelijk wordt verminderd (18). Deze kennis is gebruikt bij de ontwikkeling van een OPG-analoog geneesmiddel, een recombinant humaan monoklonaal IGg2-antilichaam Denosumab (Prolia van Amgen), dat RANKL en daardoor botresorptie remt en geïndiceerd is voor gebruik bij zowel osteoporose als botmetastasen (19;20) . Prolia heeft in verschillende klinische onderzoeken aangetoond veilig te zijn en is goedgekeurd als behandeling voor osteoporose bij zowel mannen als vrouwen (21-24). Nieuwere gegevens geven aan dat RANKL/OPG mogelijk betrokken is bij de regulatie van de pancreasfunctie, insuline- en glucagonproductie, wat een mogelijk indirect effect op de voortplanting via de bot-pancreas-gonadale as ondersteunt.

DOEL VAN DE STUDIE

Vaststellen van de betekenis van systemische RANKL-remming voor mannelijke voortplanting door te onderzoeken of Denosumab (Prolia) de spermakwaliteit kan verhogen en met name om de groep mannen te identificeren die baat zal hebben bij de behandeling.

ONTWERP

Single center, prospectieve gerandomiseerde dubbelblinde* klinisch gecontroleerde interventie.

Patienten en methodes:

95 onvruchtbare mannen, verder gezond, zullen worden geworven onder mannen die zijn verwezen voor onderzoek naar onvruchtbaarheid op de polikliniek van Dpt. van groei en reproductie, Rigshopitalet. Zowel de keuze voor deelname als de weigering hebben geen invloed op de verdere poliklinische behandeling.

De 95 deelnemers worden willekeurig toegewezen aan een van beide

• Denosumab s.c. injectie 60 mg x1, of
• Placebo, natriumchloride s.c. injectie x 1

Alle deelnemers leveren spermamonsters, bloedmonsters af en laten voor en na de ingreep een DXA-scan uitvoeren. Ze krijgen allemaal supplementen met vitamine D en calcium om hypocalciëmie te voorkomen, een bekende, tijdelijke bijwerking van Denosumab.

*dubbelblinde onderzoeken vereisen dat placebo en werkzame stof identiek zijn. Placebo is alleen verkrijgbaar bij Amgen en we konden geen placebo krijgen of kopen. In plaats daarvan zal de studie dubbelblind zijn voor de patiënt, artsen en iedereen die deelneemt aan gegevensverwerking en analyses - slechts één verpleegster die het geneesmiddel toedient, wordt ontblind. Ze zal weten of ze de werkzame stof of een placebo injecteert.

Inclusiecriteria

• Mannen ouder dan 18 jaar verwezen wegens onvruchtbaarheid bij nader onderzoek
• Spermaconcentratie ≥ 0,05 mln./ml.
• Spermaconcentratie <15 mln./ml of
• <40 % beweeglijke spermatozoer (ABC) of
• <4 % morfologisch normaal sperma (strenge criteria)

Uitsluitingscriteria

• Mannen met chronische ziekten (diabetes mellitus, schildklieraandoeningen, endocriene ziekten die behandeling vereisen, kwaadaardige ziekten of ziekten waarvan bekend is dat ze worden beïnvloed door of interfereren met vitamine D-supplementen (granulomateuze ziekten zoals sarcoïdose, tuberculose, wegeners, vasculitis evenals inflammatoire darmziekten bijv. chronische ziekte of colitis ulcerosa enz.).
• Mannen met actieve of eerdere kwaadaardige ziekte
• Elk geval met indicatie voor testisbiopsie,
• Totaal calcium < 2,14 mmol/l
• 25-OH Vitamine D < 25 nmol/L
• Slechte tandheelkundige status of tandheelkundige implantaten
• Mannen met obstructieve oligospermie of die een vasectomie hebben ondergaan
• Serum Inhibine B < 30 pg/ml
• Abnormaal karyotype
• Patiënten die overmatig sporten

STEEKPROEFGROOTTE BEREKENING EN STATISTIEKEN

Met een testniveau van 5% (significantieniveau), een power van 80% en 40 mannen in elke groep zullen we in staat zijn om een ​​verandering in het totale aantal beweeglijke zaadcellen van 75% en een verandering in de spermaconcentratie (geïndexeerd tot basiswaarde) van 25%.

We verwachten in totaal 95 man, om rekening te houden met mogelijke uitvallers. Dit komt overeen met een uitvalpercentage van 10%, als het percentage lager is, is de kans op het detecteren van een significant verschil meer dan 80%.

Aangezien we verwachten dat 50% van alle onvruchtbare mannen op de polikliniek aan de inclusiecriteria voldoet en 50% van hen instemt met deelname, voorzien we screening van in totaal 380 mannen.

BIOSTATISTISCHE ANALYSE

Alle analyses zullen worden uitgevoerd volgens de Good Clinical Practice-richtlijnen en de primaire analyses in de intention-to-treat-populatie, die alle patiënten omvatte die randomisatie ondergingen en de eerste dosis geneesmiddel kregen op dag 1. We gaan de data op 2 manieren analyseren. De primaire analyse verloopt volgens de gerandomiseerde groepsopdracht. De secundaire analyse zal gebaseerd zijn op het stratificeren van de mannen volgens subgroepanalyses in relatie tot de vooraf gedefinieerde primaire en secundaire eindpunten.

De primaire eindpunten voor dit protocol zijn veranderingen in spermaproductie, geëvalueerd door: totaal beweeglijke spermatozoa (106), totaal progressief beweeglijke spermatozoa (106), totaal spermatozoa (106) of spermaconcentratie (106/ml). Vanwege de kleine steekproefomvang en de grote intra-individuele variatie in spermaproductie zullen primaire eindpunten ook worden geëvalueerd na normalisatie tot het gemiddelde niveau voorafgaand aan de interventie. Op basis van de eerste interventie zal naar schatting 60% van de mannen baat hebben bij de behandeling en deze studie is bedoeld om te bepalen of serum OPG, RANKL of fosfaat kan worden gebruikt om mannen te identificeren die baat zullen hebben bij de behandeling. Het gebruik van deze gespecificeerde eindpunten zal nuttig zijn voor het bepalen van de werkzaamheid. Er zijn meerdere secundaire eindpunten, maar voor het initiële onderzoek zal de focus liggen op: Sperma DFI, morfologie, motiliteit, spermavolume, zwangerschapspercentage, Inhibine B, vitamine D en calciumhomeostase. Proefpersonen die hun deelname beëindigen na een bezoek na 80 dagen maar vóór bezoekdag 160 worden opgenomen voor data-analyse tot dag 80. Mannen die slechts één spermamonster afleveren of bij een bezoek gegevens missen, worden toch in de analyse opgenomen. Mannen met koorts tot 3 maanden voorafgaand aan de sperma-analyse zullen als een mogelijke confounder worden beschouwd. Die waarden worden vervolgens overgedragen voor analyses. Er wordt een significantieniveau van 5% gehanteerd. Voor de primaire analyses wordt bovendien Bonferroni-Holm p-waardecorrectie berekend. Voor de secundaire analyse wordt geen meervoudige testcorrectie gebruikt. In plaats daarvan worden de resultaten besproken met het oog op de verschillende testsituaties.

1. Analyses tussen placebo versus werkzame stof: de eerste stap zal zijn om de veranderingen in primaire uitkomsten tussen de twee groepen te vergelijken. Deze analyse laat zien of er een significant verschil is tussen de groepen. Voor alle eindpunten gemeten bij baseline en op dag 80 en 160 worden gepaarde t-testen gebruikt om te beoordelen of er een significant verschil is tussen de groepen en om te bepalen of de gemiddelde verandering binnen elke groep significant verschilt van nul. In beide gevallen worden gegevens zo nodig getransformeerd om aan de modelaannames te voldoen. Vanwege veronderstelde verschillen in onthoudingsduur zullen dezelfde analyses worden uitgevoerd na uitsluiting van mannen met een duur <48 uur voorafgaand aan of na 80 dagen behandeling. Daarna zal de initiële analyse worden uitgevoerd door middel van meervoudige regressie met relevante confounders zoals seizoen, BMI, roken, leeftijd, duur van onthouding, tijd van ejaculatie tot motiliteitsbeoordeling, koorts etc. om te zien of dit de resultaten verandert. Voor gemeten resultaten die niet kunnen worden vergeleken met t-test of andere parametrische tests op dag 1, dag 80 en dag 160, zullen groepen worden vergeleken met behulp van niet-parametrische tests zoals de Wilcoxon Mann-Whitney-test. Voor de binaire uitkomst zullen de gegevens tussen de twee groepen worden vergeleken door middel van voorwaardelijke logistische-regressieanalyse met correctie voor relevante confounders (gedefinieerd als zijnde significant geassocieerd met p<0,05). Voor uitkomsten die herhaaldelijk worden gemeten, houdt dit in dat de geschatte hellingen, of veranderingspercentages, van elke uitkomst tussen de groepen worden vergeleken. Gemengde modellen zorgen ervoor dat de correlatie tussen de herhaalde observaties basislijn-dag 1-dag 80-dag 160 van elke man op geschikte wijze kan worden opgenomen in parameterschatting. Spermaproductievariabelen zullen worden genormaliseerd naar basislijnniveaus om de enorme interindividuele variatie in het aantal zaadcellen en de spermaconcentratie te vermijden
2. Subgroepanalyse zal essentieel zijn in deze studie omdat we verwachten dat ongeveer 60% van de mannen baat zal hebben bij een behandeling met Denosumab. Analyses na stratificatie in subgroepen zullen daarom worden gebruikt om een ​​marker te identificeren voor het selecteren van de mannen die baat zullen hebben bij de behandeling. Proefpersonen zullen worden gegroepeerd op basis van hun serum-OPG en/of RANKL, RANKL/OPG-ratio, hun DNA-fragmentatie-index voorafgaand aan het begin van de interventie. Daarna zullen andere potentiële voorspellers van behandelingsrespons worden getest, zoals BMI, S-calcium, s-fosfaat, BMD, spermakwaliteit, Inhibin b, FSH op dag 80 en dag 160. Voor Serum OPG zou een dergelijke stratificatie in twee groepen kunnen zijn gescheiden door bijvoorbeeld 3 pg/ml of drie groepen, <3, 3-4 en boven 4 pg/ml. Eveneens voor RANKL en RANKL/OPG ratio en voor DNA-fragmentatie-Index zou stratificatie ook in twee groepen kunnen zijn gescheiden door b.v. DFI van 40%. De subgroepanalyses zullen in overeenstemming zijn met de normale klinische praktijk en stratificatie in geschikte groepen volgens de klinische of hoogste/laagste groepen.

SCREENING EN TIJDCURSUS

Het onderzoek start in januari 2017 en eindigt wanneer de laatste persoon uiterlijk in januari 2021 is opgenomen.

UITKOMSTMETINGEN

Eindpunten:

Primaire eindpunten

• Verandering in spermaproductie (totaal beweeglijke spermatozoa, progressief beweeglijke spermatozoa, aantal zaadcellen, spermaconcentratie)

Secundaire eindpunten

• Verandering in spermakwaliteit (-motiliteit, -morfologie, spermavolume)
• Verandering in DNA-fragmentatie (DFI) in sperma
• Verandering in serum Inhibine-B
• Verandering in serumspiegels van reproductieve hormonen (FSH, LH, AMH, testosteron, estradiol en SHBG)
• Verandering in serumprolactinespiegel
• Verandering in nuchtere glucosespiegel
• Verandering in het niveau van fastin-insuline
• Verandering in c-peptide
• Verandering in HbA1c
• Verandering in lipidenprofiel
• Verandering in botmineraaldichtheid geëvalueerd door DXA.
• Verandering in serumspiegel van inactieve vitamine D, 1,25(OH)2D3, 25-OHD3, 24,25(OH)2D3, PTH, alkalische fosfatase, geïoniseerd calcium, fosfaat, FGF23, Klotho, osteocalcine, matrix gla, osteopontin, calcitonine, pnp, procollageen III, OPG, RANKL, Sclerostin en andere botmarkers.
• Verandering in keuze van techniek voor kunstmatige voortplanting en verwekte zwangerschappen
• Verandering in spontane conceptiesnelheid
• Verandering in levend geboortecijfer
• Verandering in het aantal spermatozoa dat RANKL tot expressie brengt
• Verandering in sperma pH, HCO3-, calcium, zink, fosfaat, RANKL, RANK, OPG, FGF23, Klotho, osteocalcin, osteopontin. VDB, 24,25OH2
• Verschil in infectiepercentage in de twee groepen

SETTING, WETENSCHAPPELIJK PLAN EN AANWERVING

Deelnemers zullen worden opgenomen onder mannen die zijn doorverwezen naar het Department of Growth and Reproduction (afdeling van GR), Rigshospitalet (RH) voor evaluatie van mannelijke onvruchtbaarheid

Dit is een prospectieve, dubbelblinde, gerandomiseerde, gecontroleerde studie met twee armen. Interventiegroep: elke man krijgt Denosumab 60 mg x 1 sc alleen op dag 1 Groep die placebo krijgt: volgt dezelfde keten van gebeurtenissen, hoewel Denosumab zal worden vervangen door zoutoplossing

Alle mannen krijgen dezelfde vitamine D- en calciumsuppletie aangeboden vanaf het begin van de start van de behandeling met Denosumab of placebo: vitamine D 15 microgram en calcium 400 mg eenmaal daags.

DEELNEMERS

Screening van ~ 500 onvruchtbare mannen zal worden uitgevoerd. De onderzoekers gaan ervan uit dat ~300 mannen worden uitgesloten en ~100 mannen niet willen deelnemen. Er zullen dus 95 mannen in de studie worden opgenomen en de helft zal worden gerandomiseerd naar actieve behandeling. De onderzoekers verwachten een kleine uitval (<5) vanwege hoge motivatie en geen nadelige effecten.

ANALYSE EN INTERVENTIE

Op de afdeling worden geslachtshormonen en sperma geanalyseerd. van GR, Rigshospitalet.

ETHIEK EN BIJWERKINGEN

Alle patiënten hebben hun onderzoek voltooid voordat ze worden uitgenodigd voor het onderzoek. Ze worden op de hoogte gebracht van mogelijke bijwerkingen en kunnen op elk moment de proef verlaten zonder enige gevolgen.

Denosumab is veilig gebleken in verschillende gerandomiseerde onderzoeken en is al goedgekeurd door zowel de FDA als de EMA. Alle bijwerkingen worden nauwlettend gevolgd, geregistreerd en in geval van onverwachte frequentie van bijwerkingen of onverwachte klinische complicaties wordt dit gepubliceerd.

Op basis van eerdere fertiliteitsonderzoeken op onze afdeling verwachten we dat een groot deel van de poliklinische patiënten wil deelnemen. Naar onze mening is de geschetste studie ethisch verantwoord en wij zijn van mening dat gerandomiseerde klinische onderzoeken noodzakelijk zijn om toekomstige aanbevelingen te genereren.

PUBLICATIE VAN DE RESULTATEN

Alle resultaten, positief of negatief, zullen worden voorgelegd aan door vakgenoten beoordeelde wetenschappelijke tijdschriften. Achtereenvolgens worden gegevens verkregen en overgebracht naar een statistische database.