狄诺塞麦与男性不育症：一项随机对照试验

介绍

不孕不育是一个严重的问题，据估计影响了全球 7-26% 的所有夫妇 (1;2)。 2013 年，丹麦约有 9% 的新生儿通过辅助生殖技术受孕（丹麦生育协会）。 精液质量受损是近 50% 不育症的原因或促成因素 (3;4)。 今天，没有任何治疗方法可以改善大多数不育男性的精液质量。 相反，绝大多数不育夫妇都接受了辅助生殖技术 (ART) 治疗，而与导致不孕症的病因（母亲/父亲）无关 (3;5-8)。 治疗选择范围从温和的宫腔内人工授精 (IUI) 到更具侵入性的体外受精 (IVF) 或胞浆内单精子注射 (ICSI)。 ART 对超过 70% 的夫妇是成功的。 然而，ART 非常昂贵，并且由于侵入性方法和激素治疗的需要而与母体副作用相关，通常持续数月 (9-11)。 由于 ART 维持可接受的年出生率的成本，不孕症也是社会的经济负担。

由精液质量决定的生育潜力在胎儿时期就已确定 (12)。 如果睾丸发育不正常，成年期精液质量下降将是支持细胞功能受损的结果。 直到今天，几乎没有人研究过在成年期进行干预是否可以提高精液质量。

我们最近使用人类睾丸和维生素 D 受体敲除小鼠的研究表明，维生素 D 调节骨因子 RANKL 在睾丸中表达 (13;14)。 这是一个新发现，因为到目前为止，人们只知道 RANKL 会影响骨骼稳态，并在一定程度上影响免疫系统、炎症和泌乳 (15;16)。 在骨骼中，RANKL 在成骨细胞中表达并与其在破骨细胞中的特异性受体 RANK 结合以诱导破骨细胞生成和骨吸收 (17)。 这种激活受骨保护素 (OPG) 控制，它与 RANKL 的配体结构域结合，从而抑制 RANK 激活和破骨细胞生成，最终减少骨吸收 (18)。 这一知识已被用于开发 OPG 类似药物，一种重组人单克隆 IGg2 抗体狄诺塞麦（安进 Prolia），它抑制 RANKL，从而抑制骨吸收，并适用于骨质疏松症和骨转移 (19;20) . Prolia 在几项临床研究中被证明是安全的，并被批准用于治疗男性和女性的骨质疏松症 (21-24)。 较新的数据表明 RANKL/OPG 可能参与胰腺功能、胰岛素和胰高血糖素生成的调节，这支持可能通过骨-胰腺-性腺轴对生殖产生间接影响。

研究目的

通过研究狄诺塞麦 (Prolia) 是否可以提高精液质量来确定系统性 RANKL 抑制对男性生殖的重要性，特别是确定将从该治疗中受益的男性群体。

设计

单中心、前瞻性随机双盲*临床控制干预。

患者和方法：

95 名其他方面健康的不育男性将被招募到 Dpt 门诊接受不孕症调查的男性中。生长和繁殖，Rigshopitalet。 无论是选择参加还是拒绝参加，都不会影响进一步的门诊治疗。

95 名参与者被随机分配到接受

• 地诺单抗 s.c. 注射 60 毫克 x1，或
• 安慰剂，氯化钠 s.c. 注射 x 1

所有参与者都提供精液样本、血液样本，并在干预前后进行 DXA 扫描。 所有人都接受维生素 D 和钙补充剂以避免低钙血症，这是地诺单抗已知的暂时性副作用。

*双盲研究要求安慰剂和活性物质相同。 安慰剂只能从 Amgen 获得，我们无法收到或购买安慰剂。 相反，这项研究将对患者、医生和所有参与数据处理和分析的人采用双盲法——只有一名提供药物的护士是非盲法的。 她会知道她注射的是活性物质还是安慰剂。

纳入标准

• 男性 > 18 岁因不育需要进一步调查而转诊
• 精子浓度 ≥ 0,05 mio./ml。
• 精子浓度 <15 mio./ml 或
• <40% 活动精子 (ABC) 或
• <4% 形态正常的精子（严格标准）

排除标准

• 患有慢性疾病（糖尿病、甲状腺疾病、需要治疗的内分泌疾病、恶性疾病或已知受维生素 D 补充剂影响或干扰的疾病（肉芽肿病，如结节病、肺结核、韦格纳病、血管炎以及炎症性肠病）的男性例如 慢性病或溃疡性结肠炎等）。
• 患有活动性或既往恶性疾病的男性
• 任何有睾丸活检指征的病例，
• 总钙 < 2.14 毫摩尔/升
• 25-OH 维生素 D < 25 nmol/L
• 牙齿状况不佳或种植牙
• 患有阻塞性少精子症或输精管结扎术的男性
• 血清抑制素 B < 30 pg/ml
• 核型异常
• 过度运动的患者

样本量计算和统计

使用 5%（显着性水平）、80% 的功效和每组 40 名男性，我们将能够检测到 75% 的活动精子总数的变化以及精子浓度的变化（索引基线值）的 25%。

考虑到辍学的可能性，我们预计总共包括 95 名男性。 这对应于 10% 的辍学率，如果该比率较低，则检测到显着差异的机会将超过 80%。

由于我们预计门诊诊所所有不育男性中有 50% 符合纳入标准并且其中 50% 同意参与，因此我们预计总共需要筛查 380 名男性。

生物统计分析

所有分析都将根据良好临床实践指南和意向治疗人群的主要分析进行，其中包括接受随机分组并在第 1 天接受第一剂药物的所有患者。 我们将以两种方式分析数据。 主要分析将根据随机分组进行。 二次分析将基于根据与预定义的主要和次要终点相关的亚组分析对男性进行分层。

该方案的主要终点是精子产量的变化，评估指标为：活动精子总数 (106)、前向活动精子总数 (106)、精子总数 (106) 或精子浓度 (106/ml)。 由于样本量小和精子生成的个体差异大，主要终点也将在标准化到干预前的平均水平后进行评估。 根据第一次干预，估计 60% 的男性将从治疗中受益，本研究旨在确定血清 OPG、RANKL 或磷酸盐是否可用于识别将从治疗中受益的男性。 使用这些指定的终点将有助于确定疗效。 存在多个次要终点，但初步调查的重点将放在：精子 DFI、形态、活力、精液量、妊娠率、抑制素 B、维生素 D 和钙稳态。 在访问后 80 天但在访问第 160 天之前终止参与的受试者将被纳入到第 80 天的数据分析中。 仅提供一份精液样本或在任何访问中数据缺失的男性仍将包括在分析中。 在精液分析前 3 个月内发烧的男性将被视为潜在的混杂因素。 然后将这些值用于分析。 使用 5% 的显着性水平。 对于主要分析，额外计算 Bonferroni-Holm p 值校正。 对于二次分析，不使用多重检验校正。 取而代之的是根据多种测试情况讨论结果。

1. 安慰剂与活性物质之间的分析：第一步是比较两组主要结果的变化。 该分析将显示各组之间是否存在显着差异。 对于在基线以及第 80 天和第 160 天测量的所有终点，配对 t 检验将用于评估组之间是否存在显着差异，并确定每组内的平均变化是否与零显着不同。 在这两种情况下，数据都将根据需要进行转换以满足模型假设。 由于戒断持续时间的假设差异，在排除治疗 80 天之前或之后持续时间小于 48 小时的男性后，将进行相同的分析。 之后，将使用多元回归与相关混杂因素（如季节、BMI、吸烟、年龄、禁欲持续时间、从射精到活力评估的时间、发烧等）进行初步分析，以查看这是否会改变结果。 对于无法与第 1 天、第 80 天和第 160 天的 t 检验或其他参数检验进行比较的测量结果，将使用非参数检验（例如 Wilcoxon Mann-Whitney 检验）对各组进行比较。 对于二元结果，将通过条件逻辑回归分析对两组数据进行比较，并调整相关混杂因素（定义为显着 p<0.05 相关）。 对于重复测量的结果，这将需要比较各组之间每个结果的估计斜率或变化率。 混合模型允许将每个人的重复观察基线-天 1-天 80-天 160 之间的相关性适当地纳入参数估计。 精子生产变量将标准化为基线水平，以避免精子数量和精子浓度的巨大个体差异
2. 亚组分析在这项研究中至关重要，因为我们预计大约 60% 的男性将受益于狄诺塞麦治疗。 因此，在分层为亚组后进行的分析将用于鉴定用于选择将从治疗中获益的男性的标记。干预的开始。 之后，将在第 80 天和第 160 天测试其他潜在的治疗反应预测指标，例如 BMI、S-钙、s-磷酸盐、BMD、精液质量、抑制素 b、FSH。 对于血清 OPG，这种分层可以分为两组，例如 3 pg/ml 或三组，<3、3-4 和高于 4pg/ml。 同样，对于 RANKL 和 RANKL/OPG 比率以及对于 DNA 片段化指数分层，也可以分成两组，例如 40%的开发性金融投资。 亚组分析将根据正常临床实践和根据临床或最高/最低组在适当组中进行分层。

筛选和时程

该研究将于 2017 年 1 月启动，最迟在 2021 年 1 月最后一个人被纳入时结束。

结果测量

端点：

主要终点

• 精液产量的变化（活动精子总数、渐进式活动精子、精子数量、精子浓度）

次要终点

• 精液质量的变化（-活力，-形态，精液量）
• 精子中 DNA 碎片 (DFI) 率的变化
• 血清抑制素 B 的变化
• 生殖激素血清水平的变化（FSH、LH、AMH、睾酮、雌二醇和 SHBG）
• 血清催乳素水平的变化
• 空腹血糖水平的变化
• 禁食胰岛素水平的变化
• c肽的变化
• HbA1c 的变化
• 血脂变化
• 通过 DXA 评估的骨矿物质密度变化。
• 非活性维生素 D、1,25(OH)2D3、25-OHD3、24,25(OH)2D3、PTH、碱性磷酸酶、离子钙、磷酸盐、FGF23、Klotho、骨钙素、基质 gla、骨桥蛋白、降钙素、pnp、前胶原 III、OPG、RANKL、硬化蛋白以及其他骨标志物。
• 辅助生殖辅助技术选择的变化以及受孕
• 自发受孕率的变化
• 活产率变化
• 表达 RANKL 的精子数量变化
• 精液 pH、HCO3-、钙、锌、磷酸盐、RANKL、RANK、OPG、FGF23、Klotho、骨钙素、骨桥蛋白的变化。 VDB, 24,25OH2
• 两组感染率差异

设置、科学计划和招募

参与者将包括在 Rigshospitalet (RH) 生长与生殖部（GR 部）评估男性不育症的男性中

这是一项前瞻性、双盲、两臂随机对照试验。 干预组：每个人仅在第 1 天接受地诺单抗 60 mg x 1 皮下注射

在狄诺塞麦或安慰剂开始治疗之前，将向所有男性提供相同的维生素 D 和钙补充剂：维生素 D 15 微克和钙 400 毫克，每天一次。

参加者

将对约 500 名不育男性进行筛查。 调查人员假设约有 300 名男性将被排除在外，约有 100 名男性不想参加。 因此，该研究将包括 95 名男性，其中一半将随机接受积极治疗。 由于积极性高且无不良反应，研究人员预计会有少量退出 (<5)。

分析和干预

生殖激素和精液将在部门进行分析。 GR，Rigshospitalet。

伦理和副作用

在邀请他们参加研究之前，所有患者都将完成他们的调查。 他们将被告知潜在的不利影响，并且他们可以随时退出试验而不会产生任何后果。

Denosumab 在几项随机研究中被证明是安全的，并且已经获得 FDA 和 EMA 的批准。 将密切监测、记录所有副作用，如果出现意外的不良反应频率或意外的临床并发症，将予以公布。

根据我们部门之前的生育研究，我们预计大部分门诊患者都希望参加。 在我们看来，概述的研究在伦理上是合理的，而且我们认为，为了产生未来的建议，有必要进行随机临床试验。

公布结果

所有结果，无论是正面的还是负面的，都将提交给同行评审的科学期刊。 将依次获取数据并将其传输到统计数据库。