Denosumab a mužská neplodnost: RCT

ÚVOD

Neplodnost je vážný problém, který podle odhadů postihuje 7–26 % všech párů na celém světě (1;2). Přibližně 9 % všech novorozenců bylo počato technikami asistované reprodukce v roce 2013 v Dánsku (Danish Fertility Society). Zhoršená kvalita spermatu je kauzálním nebo přispívajícím faktorem téměř v 50 % všech případů neplodnosti (3;4). Dnes neexistuje žádná léčba, která by mohla zlepšit kvalitu spermatu většiny neplodných mužů. Namísto toho je velká většina neplodných párů léčena technikami asistované reprodukce (ART) nezávisle na etiologii (mateřská/otcovská) způsobující neplodnost [3;5-8]. Volba léčby sahá od mírné intrauterinní inseminace (IUI) po invazivnější in vitro fertilizaci (IVF) nebo intracytoplazmatickou injekci spermie (ICSI). ART je úspěšná u více než 70 % všech párů. ART je však velmi nákladná a spojená s vedlejšími účinky na matku kvůli invazivní metodice a potřebě hormonální léčby, často po dobu několika měsíců [9-11]. Neplodnost je také finanční zátěží pro společnost kvůli nákladům na ART na udržení přijatelné roční porodnosti.

Plodný potenciál určený kvalitou spermatu je stanoven již jako plod (12). V případě, že se varlata nevyvíjejí normálně, bude důsledkem zhoršené funkce Sertoliho buněk snížená kvalita spermatu v dospělosti. Až do dnešního dne bylo stěží prozkoumáno, zda intervence v dospělosti může zlepšit kvalitu spermatu.

Naše nedávné studie s použitím lidských varlat a myší s knock-outem receptoru vitamínu D odhalily, že vitamín D regulovaný kostní faktor RANKL je exprimován ve varlatech (13;14). To je nové zjištění, protože až dosud bylo známo, že RANKL ovlivňuje pouze kostní homeostázu a do určité míry ovlivňuje imunitní systém, zánět a laktaci (15;16). Ve skeletu je RANKL exprimován v osteoblastech a váže se na svůj specifický receptor RANK v osteoklastech, aby indukoval osteoklastogenezi a kostní resorpci (17). Tato aktivace je řízena osteoprotegerinem (OPG), který se váže na ligandovou doménu RANKL, a tak inhibuje aktivaci RANK a osteoklastogenezi, což v konečném důsledku snižuje kostní resorpci (18). Tyto poznatky byly využity při vývoji léku analogického OPG, rekombinantní lidské monoklonální IGg2 protilátky Denosumab (Prolia od Amgen), která inhibuje RANKL a tím kostní resorpci a je indikována k použití jak u osteoporózy, tak u kostních metastáz (19;20). . Prolia se v několika klinických studiích ukázala jako bezpečná a je schválena jako léčba osteoporózy u mužů i žen (21-24). Novější údaje naznačují, že RANKL/OPG se může podílet na regulaci funkce slinivky břišní, produkce inzulínu a glukagonu, což podporuje možný nepřímý účinek na reprodukci prostřednictvím osy kost-pankreaticko-gonadální.

CÍL STUDIA

Stanovit význam systémové inhibice RANKL pro mužskou reprodukci zkoumáním, zda Denosumab (Prolia) může zvýšit kvalitu spermatu, a zejména identifikovat skupinu mužů, kteří budou mít z léčby prospěch.

DESIGN

Jednocentrová, prospektivní randomizovaná dvojitě zaslepená* klinicky kontrolovaná intervence.

Pacienti a metody:

95 neplodných mužů, jinak zdravých, bude přijato mezi muže odeslané k vyšetření pro neplodnost na ambulanci dpt. of Growth and Reproduction, Rigshopitalet. Ani volba účasti, ani odmítnutí neovlivní další ambulantní léčbu.

95 účastníků je náhodně rozděleno do jedné z nich

• Denosumab s.c. injekce 60 mg x1, popř
• Placebo, chlorid sodný s.c. vstřik x 1

Všichni účastníci doručí vzorky spermatu, vzorky krve a nechají si provést DXA sken před a po zákroku. Všichni dostávají doplňky s vitamínem D a vápníkem, aby se vyhnuli hypokalcémii, známému dočasnému vedlejšímu účinku Denosumabu.

*dvojitě zaslepené studie vyžadují, aby placebo a účinná látka byly totožné. Placebo lze získat pouze od společnosti Amgen a my jsme nebyli schopni získat ani zakoupit placebo. Místo toho bude studie dvojitě zaslepená pro pacienty, lékaře a všechny, kdo se podílejí na zpracování dat a analýzách – pouze jedna sestra podávající lék bude zaslepena. Bude vědět, zda injekčně aplikuje účinnou látku nebo placebo.

Kritéria pro zařazení

• Muži ve věku > 18 let doporučeni z důvodu neplodnosti, kteří potřebují další vyšetření
• Koncentrace spermií ≥ 0,05 mil./ml.
• Koncentrace spermií <15 mil./ml nebo
• <40 % pohyblivých spermií (ABC) nebo
• <4 % morfologicky normální spermie (přísná kritéria)

Kritéria vyloučení

• Muži s chronickými onemocněními (diabetes mellitus, onemocnění štítné žlázy, endokrinní onemocnění vyžadující léčbu, maligní onemocnění nebo onemocnění, o nichž je známo, že jsou ovlivněny doplňky vitaminu D nebo interferují s nimi (granulomatózní onemocnění, jako je sarkoidóza, tuberkulóza, wegeners, vaskulitida, stejně jako zánětlivá onemocnění střev např. chronická nemoc nebo ulcerózní kolitida atd.).
• Muži s aktivním nebo předchozím maligním onemocněním
• Jakýkoli případ s indikací k biopsii varlat,
• Celkový vápník < 2,14 mmol/l
• 25-OH Vitamin D < 25 nmol/L
• Špatný stav chrupu nebo zubní implantáty
• Muži s obstrukční oligospermií nebo muži po vazektomii
• Sérový inhibin B < 30 pg/ml
• Abnormální karyotyp
• Pacienti praktikující nadměrné cvičení

UKÁZKOVÝ VÝPOČET VELIKOSTI A STATISTIKY

S hladinou testu 5 % (hladina významnosti), silou 80 % a 40 muži v každé skupině budeme schopni detekovat změnu celkového počtu pohyblivých spermií o 75 % a změnu koncentrace spermií (indexovaná na základní hodnotu) 25 %.

Očekáváme, že zahrneme celkem 95 mužů, abychom vzali v úvahu možnost výpadků. To odpovídá míře opuštění 10 %, v případě, že je míra nižší, bude šance na odhalení významného rozdílu vyšší než 80 %.

Vzhledem k tomu, že očekáváme, že 50 % všech neplodných mužů v ambulanci splní kritéria pro zařazení a 50 % z nich bude souhlasit s účastí, předpokládáme screening celkem 380 mužů.

BIOSTISTICKÁ ANALÝZA

Všechny analýzy budou provedeny podle pokynů správné klinické praxe a primárních analýz v populaci s úmyslem léčit, která zahrnovala všechny pacienty, kteří podstoupili randomizaci a dostali první dávku léku v den 1. Data budeme analyzovat 2 způsoby. Primární analýza bude probíhat podle randomizované skupiny. Sekundární analýza bude založena na stratifikaci mužů podle analýz podskupin ve vztahu k předem definovaným primárním a sekundárním cílům.

Primárními cílovými body pro tento protokol budou změny v produkci spermií hodnocené podle: celkového počtu pohyblivých spermií (106), celkového počtu progresivních pohyblivých spermií (106), celkového počtu spermií (106) nebo koncentrace spermií (106/ml). Vzhledem k malé velikosti vzorku a velkým intraindividuálním variacím v produkci spermií budou primární koncové body také hodnoceny po normalizaci na průměrnou průměrnou úroveň před intervencí. Na základě prvního zásahu se odhaduje, že 60 % mužů bude mít prospěch z léčby a tato studie je navržena tak, aby určila, zda lze použít sérový OPG, RANKL nebo fosfát k identifikaci mužů, kteří budou mít prospěch z léčby. Použití těchto specifikovaných koncových bodů bude užitečné pro stanovení účinnosti. Existuje mnoho sekundárních cílových bodů, ale pro počáteční výzkum se zaměříme na: DFI spermií, morfologii, pohyblivost, objem spermatu, míru těhotenství, inhibin B, vitamin D a homeostázu vápníku. Subjekty, které ukončí účast po návštěvě po 80 dnech, ale před návštěvním dnem 160, budou zahrnuty do analýzy dat až do 80. dne. Muži, kteří dodají pouze jeden vzorek spermatu nebo mají chybějící údaje při jakékoli návštěvě, budou stále zahrnuti do analýzy. Muži s horečkou do 3 měsíců před analýzou spermatu budou považováni za potenciálního matoucího. Tyto hodnoty budou následně přeneseny do analýz. Používá se hladina významnosti 5 %. Pro primární analýzy se dodatečně počítá Bonferroni-Holmova korekce p-hodnoty. Pro sekundární analýzu se nepoužívá vícenásobná korekce testu. Místo toho jsou výsledky diskutovány s ohledem na různé testovací situace.

1. Analýzy mezi placebem a účinnou látkou: Prvním krokem bude srovnání změn v primárních výsledcích napříč dvěma skupinami. Tato analýza ukáže, zda existuje významný rozdíl mezi skupinami. Pro všechny koncové body měřené na začátku a 80. a 160. den se použijí párové t-testy k posouzení, zda existuje významný rozdíl mezi skupinami, a ke stanovení, zda se průměrná změna v každé skupině významně liší od nuly. V obou případech budou data podle potřeby transformována tak, aby splňovala předpoklady modelu. Vzhledem k předpokládaným rozdílům v trvání abstinence budou stejné analýzy provedeny po vyloučení mužů s trváním < 48 hodin před nebo po 80 dnech léčby. Poté bude provedena počáteční analýza pomocí vícenásobné regrese s relevantními faktory, jako je sezóna, BMI, kouření, věk, délka abstinence, doba od ejakulace do hodnocení motility, horečka atd., aby se zjistilo, zda to změní výsledky. U naměřených výsledků, které nelze porovnat s t-testem nebo jinými parametrickými testy v den 1, den 80 a den 160, budou skupiny porovnány pomocí neparametrických testů, jako je Wilcoxon Mann-Whitney test. Pro binární výsledek budou data porovnána mezi těmito dvěma skupinami pomocí podmíněné logisticko-regresní analýzy s úpravou na relevantní zmatky (definované jako významně asociované s p<0,05). U výsledků měřených opakovaně to bude vyžadovat porovnání odhadovaných sklonů nebo rychlostí změn každého výsledku mezi skupinami. Smíšené modely umožňují, aby korelace mezi opakovanými pozorováními na začátku 1. dne 80. dne 160 od každého muže byla vhodně začleněna do odhadu parametrů. Proměnné produkce spermií budou normalizovány na výchozí hodnoty, aby se předešlo velkým interindividuálním změnám v počtu spermií a koncentraci spermií
2. Analýza podskupin bude v této studii zásadní, protože očekáváme, že asi 60 % mužů bude mít prospěch z léčby denosumabem. Analýzy po stratifikaci do podskupin budou proto použity k identifikaci markeru pro výběr mužů, kteří budou mít prospěch z léčby Subjekty budou seskupeny podle jejich sérového OPG a/nebo poměru RANKL, RANKL/OPG, jejich indexu fragmentace DNA před začátek zásahu. Poté budou testovány další potenciální prediktory léčebné odpovědi, jako je BMI, S-vápník, s-fosfát, BMD, kvalita spermatu, Inhibin b, FSH v den 80 a den 160. Pro sérový OPG by taková stratifikace mohla být ve dvou skupinách oddělených například 3 pg/ml nebo třemi skupinami, <3, 3-4 a nad 4 pg/ml. Podobně pro poměr RANKL a RANKL/OPG a pro stratifikaci DNA-fragmentace-index může být také ve dvou skupinách oddělených např. DFI 40 %. Analýzy podskupin budou v souladu s běžnou klinickou praxí a stratifikací do příslušných skupin podle klinické nebo nejvyšší/nejnižší skupiny.

PROMÍTÁNÍ A ČASOVÝ PRŮBĚH

Studie bude zahájena v lednu 2017 a skončí po zařazení poslední osoby nejpozději v lednu 2021.

MĚŘENÍ VÝSLEDKŮ

Koncové body:

Primární koncové body

• Změna produkce spermatu (celkové pohyblivé spermie, progresivní pohyblivé spermie, počet spermií, koncentrace spermií)

Sekundární koncové body

• Změna kvality spermatu (-motilita, -morfologie, objem spermatu)
• Změna rychlosti fragmentace DNA (DFI) ve spermatu
• Změna sérového inhibinu-B
• Změna sérových hladin reprodukčních hormonů (FSH, LH, AMH, testosteron, estradiol a SHBG)
• Změna hladiny prolaktinu v séru
• Změna hladiny glukózy nalačno
• Změna hladiny fastinového inzulínu
• Změna c-peptidu
• Změna HbA1c
• Změna lipidového profilu
• Změna hustoty kostního minerálu hodnocená pomocí DXA.
• Změna sérové ​​hladiny inaktivního vitaminu D, 1,25(OH)2D3, 25-OHD3, 24,25(OH)2D3, PTH, alkalické fosfatázy, ionizovaného vápníku, fosfátu, FGF23, Klotho, osteokalcinu, matrix gla, osteopontinu, kalcitonin, pnp, prokolagen III, OPG, RANKL, sklerostin a také další kostní marker.
• Změna ve výběru techniky asistované reprodukce a také početí těhotenství
• Změna rychlosti spontánního početí
• Změna v porodnosti
• Změna počtu spermií exprimujících RANKL
• Změna pH semene, HCO3-, vápník, zinek, fosfát, RANKL, RANK, OPG, FGF23, Klotho, osteokalcin, osteopontin. VDB, 24,25OH2
• Rozdíl v míře infekce v obou skupinách

SETTING, VĚDECKÝ PLÁN A NÁBOR

Účastníci budou zařazeni mezi muže doporučené na Oddělení růstu a reprodukce (odd. GR), Rigshospitalet (RH) pro hodnocení mužské neplodnosti.

Toto je prospektivní, dvojitě zaslepená, dvouramenná randomizovaná kontrolovaná studie. Intervenční skupina: Každý muž dostane Denosumab 60 mg x 1 sc pouze v den 1 Skupina dostávající placebo: Bude následovat stejný řetězec událostí, ačkoli Denosumab bude nahrazen fyziologickým roztokem

Všem mužům bude nabídnuta stejná suplementace vitaminu D a vápníku počínaje před zahájením léčby denosumabem nebo placebem: vitamin D 15 mikrogramů a vápník 400 mg jednou denně.

ÚČASTNÍCI

Bude proveden screening ~500 neplodných mužů. Vyšetřovatelé předpokládají, že bude vyloučeno ~ 300 mužů a ~ 100 mužů se nechce zúčastnit. Do studie tedy bude zařazeno 95 mužů a polovina bude randomizována k aktivní léčbě. Vyšetřovatelé očekávají malý výpadek (<5) kvůli vysoké motivaci a žádné nežádoucí účinky.

ANALÝZA A INTERVENCE

Reprodukční hormony a sperma budou analyzovány na odd. z GR, Rigshospitalet.

ETIKA A VEDLEJŠÍ ÚČINKY

Před pozváním do studie všichni pacienti dokončí své vyšetření. Budou informováni o potenciálních nepříznivých účincích a mohou kdykoli opustit zkoušku bez jakýchkoli následků.

V několika randomizovaných studiích bylo prokázáno, že denosumab je bezpečný a je již schválen FDA i EMA. Všechny nežádoucí účinky budou pečlivě sledovány, registrovány a v případě neočekávané frekvence nežádoucích účinků nebo neočekávaných klinických komplikací budou zveřejněny.

Na základě předchozích studií fertility na našem oddělení očekáváme, že se bude chtít zúčastnit velká část ambulantních pacientů. Podle našeho názoru je nastíněná studie eticky správná a věříme, že pro vytvoření budoucích doporučení jsou nezbytné randomizované klinické studie.

PUBLIKACE VÝSLEDKŮ

Všechny výsledky, pozitivní nebo negativní, budou předloženy recenzovaným vědeckým časopisům. Data budou postupně získávána a přenášena do statistické databáze.