Denosumabe e infertilidade masculina: um RCT

INTRODUÇÃO

A infertilidade é um problema sério que afeta 7-26% de todos os casais em todo o mundo (1;2). Aproximadamente 9% de todos os recém-nascidos foram concebidos por técnicas de reprodução assistida em 2013 na Dinamarca (Danish Fertility Society). A qualidade prejudicada do sêmen é o fator causal ou contribuinte em quase 50% de todos os casos de infertilidade (3;4). Hoje, não existem tratamentos que possam melhorar a qualidade do sêmen da maioria dos homens inférteis. Em vez disso, a grande maioria dos casais inférteis é tratada com técnicas de reprodução assistida (ART), independentemente da etiologia (materna/paterna) causadora da infertilidade (3;5-8). A escolha do tratamento varia de inseminações intrauterinas (IUI) leves a fertilização in vitro (FIV) mais invasiva ou injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI). A ART é bem-sucedida para mais de 70% de todos os casais. No entanto, a TARV é muito cara e está associada a efeitos colaterais maternos devido à metodologia invasiva e à necessidade de tratamento hormonal, muitas vezes por vários meses (9-11). A infertilidade também é um fardo financeiro para a sociedade devido aos custos da TARV para manter uma taxa de natalidade anual aceitável.

O potencial de fertilidade determinado pela qualidade do sêmen já é estabelecido como feto (12). Caso os testículos não se desenvolvam normalmente, a qualidade reduzida do sêmen na idade adulta será o resultado do comprometimento da função das células de Sertoli. Até hoje pouco se investigou se a intervenção na idade adulta pode melhorar a qualidade do sêmen.

Nossos estudos recentes usando testículos humanos e camundongos knock-out para o receptor de vitamina D revelaram que o fator ósseo RANKL regulado pela vitamina D é expresso no testículo (13;14). Esta é uma descoberta nova, porque até agora o RANKL era conhecido apenas por afetar a homeostase óssea e, de certa forma, influenciar o sistema imunológico, a inflamação e a lactação (15;16). No esqueleto, o RANKL é expresso em osteoblastos e se liga ao seu receptor RANK específico em osteoclastos para induzir osteoclastogênese e reabsorção óssea (17). Essa ativação é controlada pela osteoprotegerina (OPG), que se liga ao domínio ligante do RANKL e, assim, inibe a ativação do RANK e a osteoclastogênese, reduzindo a reabsorção óssea (18). Este conhecimento foi utilizado no desenvolvimento de uma droga análoga à OPG, um anticorpo monoclonal IGg2 humano recombinante Denosumab (Prolia da Amgen), que inibe o RANKL e, portanto, a reabsorção óssea e é indicado para uso em osteoporose e metástases ósseas (19;20) . Prolia demonstrou ser seguro em vários estudos clínicos e é aprovado como tratamento para osteoporose em homens e mulheres (21-24). Dados mais recentes indicam que o RANKL/OPG pode estar envolvido na regulação da função pancreática, produção de insulina e glucagon, o que sustenta um possível efeito indireto na reprodução através do eixo osso-pancreático-gonadal.

OBJETIVO DO ESTUDO

Determinar a importância da inibição sistêmica do RANKL para a reprodução masculina, investigando se o Denosumab (Prolia) pode aumentar a qualidade do sêmen e, particularmente, identificar o grupo de homens que se beneficiará com o tratamento.

PROJETO

Centro único, intervenção clínica controlada prospectiva, randomizada, duplo-cega*.

Pacientes e métodos:

95 homens inférteis, saudáveis, serão recrutados entre os homens encaminhados para investigação de infertilidade no ambulatório do Dpt. de Crescimento e Reprodução, Rigshopitalet. Nem escolher participar, nem recusar, afetará o tratamento ambulatorial.

Os 95 participantes são alocados aleatoriamente para receber

• Denosumabe s.c. injeção 60 mg x1, ou
• Placebo, cloreto de sódio s.c. injeção x 1

Todos os participantes entregam amostras de sêmen, amostras de sangue e realizam DXA-scan antes e depois da intervenção. Todos recebem suplementos com vitamina D e cálcio para evitar a hipocalcemia, um conhecido efeito colateral temporário do denosumabe.

*estudos duplo-cegos requerem que o placebo e a substância ativa sejam idênticos. O placebo só pode ser obtido na Amgen e não pudemos receber ou comprar placebo. Em vez disso, o estudo será duplo-cego para pacientes, médicos e todos os que participarem do tratamento e análise de dados - apenas uma enfermeira que administra o medicamento será desvendada. Ela saberá se injeta substância ativa ou placebo.

Critério de inclusão

• Homens > 18 anos encaminhados por infertilidade com necessidade de investigação adicional com
• Concentração de esperma ≥ 0,05 mio./ml.
• Concentração de esperma <15 milhões/ml ou
• <40% espermatozóides móveis (ABC) ou
• <4% de espermatozoides morfologicamente normais (critérios rígidos)

Critério de exclusão

• Homens com doenças crônicas (diabetes mellitus, doenças da tireoide, doenças endócrinas que requerem tratamento, doenças malignas ou doenças conhecidas por serem afetadas ou interferir com suplementos de vitamina D (doenças granulomatosas como sarcoidose, tuberculose, wegeners, vasculite, bem como doenças inflamatórias intestinais por exemplo. doença crônica ou colite ulcerosa, etc.).
• Homens com doença maligna ativa ou prévia
• Qualquer caso com indicação de biópsia de testículo,
• Cálcio total < 2,14 mmol/l
• 25-OH Vitamina D < 25 nmol/L
• Mau estado dentário ou implantes dentários
• Homens com oligospermia obstrutiva ou vasectomizados
• Inibina B sérica < 30 pg/ml
• cariótipo anormal
• Pacientes que praticam exercícios excessivos

CÁLCULO E ESTATÍSTICAS DO TAMANHO DA AMOSTRA

Com um nível de teste de 5% (nível de significância), um poder de 80% e 40 homens em cada grupo, seremos capazes de detectar uma alteração no número total de espermatozoides móveis de 75% e uma alteração na concentração de espermatozóides (indexada ao valor da linha de base) de 25%.

Esperamos incluir um total de 95 homens, para levar em conta a possibilidade de desistências. Isso corresponde a uma taxa de evasão de 10%, caso a taxa seja menor, as chances de detectar uma diferença significativa serão acima de 80%.

Como esperamos que 50% de todos os homens inférteis no ambulatório atendam aos critérios de inclusão e 50% deles concordem em participar, prevemos a triagem de 380 homens no total.

ANÁLISE BIOSTATÍSTICA

Todas as análises serão realizadas de acordo com as diretrizes de Boas Práticas Clínicas e as análises primárias na população com intenção de tratar, que incluiu todos os pacientes que foram randomizados e receberam a primeira dose do medicamento no dia 1. Analisaremos os dados de 2 maneiras. A análise primária prosseguirá de acordo com a atribuição do grupo randomizado. A análise secundária será baseada na estratificação dos homens de acordo com as análises de subgrupo em relação aos endpoints primários e secundários predefinidos.

Os pontos finais primários para este protocolo serão alterações na produção de esperma avaliada por: espermatozóides móveis totais (106), espermatozóides móveis progressivos totais (106), espermatozóides totais (106) ou concentração de espermatozoides (106/ml). Devido ao pequeno tamanho da amostra e grande variação intraindividual na produção de esperma, os endpoints primários também serão avaliados após a normalização para o nível médio antes da intervenção. Com base na primeira intervenção, estima-se que 60% dos homens se beneficiarão com o tratamento e este estudo foi elaborado para determinar se OPG sérico, RANKL ou fosfato podem ser usados ​​para identificar homens que se beneficiarão com o tratamento. A utilização destes parâmetros especificados será útil para determinar a eficácia. Existem vários endpoints secundários, mas para a investigação inicial, o foco será em: DFI do esperma, morfologia, motilidade, volume do sêmen, taxa de gravidez, inibina B, vitamina D e homeostase do cálcio. Os indivíduos que encerram a participação após a visita aos 80 dias, mas antes do dia 160 da visita, serão incluídos para análise de dados até o dia 80. Os homens que entregarem apenas uma amostra de sêmen ou tiverem dados ausentes em qualquer visita ainda serão incluídos na análise. Homens com febre até 3 meses antes da análise do sêmen serão considerados como um fator de confusão em potencial. Esses valores serão então levados para análise. É utilizado um nível de significância de 5%. Para as análises primárias, a correção do valor p de Bonferroni-Holm é calculada adicionalmente. Para a análise secundária, nenhuma correção de teste múltiplo é usada. Em vez disso, os resultados são discutidos tendo em vista as múltiplas situações de teste.

1. Análises entre placebo versus substância ativa: O primeiro passo será comparar as mudanças nos resultados primários entre os dois grupos. Esta análise mostrará se há uma diferença significativa entre os grupos. Para todos os endpoints medidos na linha de base e nos dias 80 e 160, testes t pareados serão usados ​​para avaliar se há uma diferença significativa entre os grupos e determinar se a alteração média dentro de cada grupo difere significativamente de zero. Em ambos os casos, os dados serão transformados conforme necessário para atender às suposições do modelo. Devido a diferenças presumidas na duração da abstinência, as mesmas análises serão realizadas após a exclusão de homens com duração <48 horas antes ou após 80 dias de tratamento. Posteriormente, a análise inicial será realizada usando regressão múltipla com fatores de confusão relevantes, como estação do ano, IMC, tabagismo, idade, duração da abstinência, tempo desde a ejaculação até a avaliação da motilidade, febre, etc., para verificar se isso altera os resultados. Para resultados medidos que não podem ser comparados com o teste t ou outros testes paramétricos no dia 1, dia 80 e dia 160, os grupos serão comparados usando testes não paramétricos, como o teste de Wilcoxon Mann-Whitney. Para o desfecho Binário, os dados serão comparados entre os dois grupos por meio de análise de regressão logística condicional com ajuste para fatores de confusão relevantes (definidos como sendo significativamente p<0,05 associados). Para resultados medidos repetidamente, isso implicará comparar as inclinações estimadas, ou taxas de mudança, de cada resultado entre os grupos. Os modelos mistos permitem que a correlação entre as observações repetidas da linha de base-dia 1-dia 80-dia 160 de cada homem seja adequadamente incorporada na estimativa de parâmetros. As variáveis ​​de produção de esperma serão normalizadas para níveis basais para evitar a enorme variação interindividual na contagem e concentração de esperma
2. A análise de subgrupos será essencial neste estudo porque esperamos que cerca de 60% dos homens se beneficiem do tratamento com Denosumab. As análises após a estratificação em subgrupos serão, portanto, usadas para identificar um marcador para selecionar os homens que se beneficiarão do tratamento Os indivíduos serão agrupados de acordo com seu OPG sérico e/ou RANKL, razão RANKL/OPG, seu índice de fragmentação de DNA antes de o início da intervenção. Posteriormente, outros potenciais preditores de resposta ao tratamento serão testados, como IMC, S-cálcio, s-fosfato, DMO, qualidade do sêmen, Inibina b, FSH no dia 80 e no dia 160. Para OPG sérico, tal estratificação pode ser em dois grupos separados por, por exemplo, 3 pg/ml ou três grupos, <3, 3-4 e acima de 4pg/ml. Da mesma forma para a razão RANKL e RANKL/OPG e para a estratificação do índice de fragmentação do DNA também pode ser em dois grupos separados por, e. DFI de 40%. As análises de subgrupo estarão de acordo com a prática clínica normal e a estratificação em grupos apropriados de acordo com os grupos clínicos ou mais altos/mais baixos.

EXAME E CURSO DE TEMPO

O estudo será iniciado em janeiro de 2017 e terminará quando a última pessoa for incluída, em janeiro de 2021.

MEDIDAS DE RESULTADOS

Pontos finais:

Endpoints primários

• Alteração na produção de sêmen (total de espermatozóides móveis, espermatozóides móveis progressivos, contagem de espermatozoides, concentração de espermatozoides)

Pontos de extremidade secundários

• Mudança na qualidade do sêmen (-motilidade, -morfologia, volume do sêmen)
• Mudança na taxa de fragmentação do DNA (DFI) no esperma
• Alteração na Inibina-B sérica
• Alteração nos níveis séricos dos hormônios reprodutivos (FSH, LH, AMH, testosterona, estradiol e SHBG)
• Alteração no nível sérico de prolactina
• Alteração no nível de glicose em jejum
• Alteração no nível de insulina fastina
• Mudança no peptídeo c
• Mudança na HbA1c
• Mudança no perfil lipídico
• Alteração na densidade mineral óssea avaliada por DXA.
• Alteração no nível sérico de vitamina D inativa, 1,25(OH)2D3, 25-OHD3, 24,25(OH)2D3, PTH, fosfatase alcalina, cálcio ionizado, fosfato, FGF23, Klotho, osteocalcina, matriz gla, osteopontina, calcitonina, pnp, procolágeno III, OPG, RANKL, esclerostina, bem como outros marcadores ósseos.
• Mudança na escolha da técnica de assistência à reprodução assistida, bem como gravidezes concebidas
• Mudança na taxa de concepção espontânea
• Mudança na taxa de nascidos vivos
• Mudança no número de espermatozóides que expressam RANKL
• Alteração no pH do sêmen, HCO3-, cálcio, zinco, fosfato, RANKL, RANK, OPG, FGF23, Klotho, osteocalcina, osteopontina. VDB, 24,25OH2
• Diferença na taxa de infecção nos dois grupos

DEFINIÇÃO, PLANO CIENTÍFICO E RECRUTAMENTO

Os participantes serão incluídos entre os homens encaminhados ao Departamento de Crescimento e Reprodução (departamento de GR), Rigshospitalet (RH) para avaliação de infertilidade masculina

Este é um estudo prospectivo, duplo-cego, randomizado e controlado. Grupo de intervenção: Cada homem receberá Denosumabe 60 mg x 1 sc apenas no dia 1 Grupo recebendo placebo: Seguirá a mesma cadeia de eventos, embora o Denosumabe seja substituído por solução salina

Todos os homens receberão a mesma suplementação de vitamina D e cálcio começando antes do início do tratamento com Denosumabe ou placebo: vitamina D 15 microgramas e cálcio 400 mg uma vez ao dia.

PARTICIPANTES

A triagem de aproximadamente 500 homens inférteis será realizada. Os investigadores assumem que cerca de 300 homens serão excluídos e cerca de 100 homens não desejam participar. Assim, 95 homens serão incluídos no estudo e metade será randomizada para o tratamento ativo. Os investigadores esperam uma pequena desistência (<5) devido à alta motivação e à ausência de efeitos adversos.

ANÁLISE E INTERVENÇÃO

Hormônios reprodutivos e sêmen serão analisados ​​no departamento. de GR, Rigshospitalet.

ÉTICA E EFEITOS COLATERAIS

Todos os pacientes terão preenchido sua investigação, antes de serem convidados para o estudo. Eles serão informados sobre possíveis efeitos adversos e poderão abandonar o estudo a qualquer momento sem nenhuma consequência.

O denosumabe provou ser seguro em vários estudos randomizados e já foi aprovado pela FDA e pela EMA. Todos os efeitos colaterais serão monitorados de perto, registrados e, em caso de frequência inesperada de efeitos adversos ou complicações clínicas inesperadas, serão publicados.

Com base em estudos anteriores de fertilidade em nosso departamento, esperamos que uma grande proporção de pacientes ambulatoriais deseje participar. Em nossa opinião, o estudo delineado é ético e acreditamos que, para gerar recomendações futuras, são necessários ensaios clínicos randomizados.

PUBLICAÇÃO DOS RESULTADOS

Todos os resultados, positivos ou negativos, serão submetidos a revistas científicas revisadas por pares. Os dados serão sucessivamente obtidos e transferidos para uma base de dados estatística.