Denosumab og mandlig infertilitet: en RCT

INTRODUKTION

Infertilitet er et alvorligt problem, der vurderes at påvirke 7-26% af alle par globalt (1;2). Cirka 9 % af alle nyfødte blev undfanget med assisteret befrugtning i 2013 i Danmark (Dansk Fertilitetsforening). Forringet sædkvalitet er årsagen eller medvirkende faktor i næsten 50 % af alle tilfælde af infertilitet (3;4). I dag findes der ingen behandlinger, der kan forbedre sædkvaliteten hos de fleste infertile mænd. I stedet behandles langt de fleste infertile par med assisteret reproduktionsteknikker (ART) uafhængigt af ætiologien (maternal/faderlig), der forårsager infertiliteten (3;5-8). Behandlingsvalget spænder fra milde intrauterine inseminationer (IUI) til mere invasiv in vitro fertilisering (IVF) eller intracytoplasmatisk spermainjektion (ICSI). ART har succes for mere end 70 % af alle par. ART er dog meget dyrt og forbundet med maternelle bivirkninger på grund af den invasive metodik og behovet for hormonbehandling, ofte i flere måneder (9-11). Infertilitet er også en økonomisk byrde for samfundet på grund af omkostningerne ved ART for at opretholde en acceptabel årlig fødselsrate.

Fertilitetspotentiale bestemt af sædkvalitet er etableret allerede som foster (12). I tilfælde af at testiklerne ikke udvikler sig normalt, vil nedsat sædkvalitet i voksenalderen være resultatet som følge af nedsat Sertoli-cellefunktion. Indtil i dag er det knap blevet undersøgt, om intervention i voksenalderen kan forbedre sædkvaliteten.

Vores nylige undersøgelser med både humane testikler og vitamin D-receptor knock-out mus afslørede, at den vitamin D regulerede knoglefaktor RANKL er udtrykt i testiklerne (13;14). Dette er et nyt fund, fordi RANKL indtil nu kun har været kendt for at påvirke knoglehomeostase og i nogen grad påvirke immunsystemet, inflammation og amning (15;16). I skelettet udtrykkes RANKL i osteoblaster og binder til dets specifikke receptor RANK i osteoklaster for at inducere osteoklastogenese og knogleresorption (17). Denne aktivering styres af osteoprotegerin (OPG), som binder til liganddomænet af RANKL og dermed hæmmer RANK-aktivering og osteoklastogenese, hvilket i sidste ende reducerer knogleresorption (18). Denne viden er blevet brugt til udvikling af et OPG-analogt lægemiddel, et rekombinant humant monoklonalt IGg2-antistof Denosumab (Prolia by Amgen), som hæmmer RANKL og dermed knogleresorption og er indiceret til brug ved både osteoporose og knoglemetastaser (19;20) . Prolia har i flere kliniske studier vist sig at være sikker og er godkendt som behandling for osteoporose hos både mænd og kvinder (21-24). Nyere data indikerer, at RANKL/OPG kan være involveret i regulering af bugspytkirtelfunktionen, insulin- og glukagonproduktion, hvilket understøtter en mulig indirekte effekt på reproduktion gennem knogle-pancreas-gonadeaksen.

FORMÅL MED STUDIE

At bestemme betydningen af ​​systemisk RANKL-hæmning for mandlig reproduktion ved at undersøge, om Denosumab (Prolia) kan øge sædkvaliteten og især at identificere den gruppe af mænd, der vil have gavn af behandlingen.

DESIGN

Enkeltcenter, prospektiv randomiseret dobbeltblindet* klinisk kontrolleret intervention.

Patienter og metoder:

95 infertile mænd, i øvrigt raske, vil blive rekrutteret blandt mænd henvist til udredning for infertilitet i ambulatoriet på Dpt. for Vækst og Reproduktion, Rigshopitalet. Hverken valg af deltagelse eller afslag vil påvirke den videre ambulatoriebehandling.

De 95 deltagere er tilfældigt fordelt til at modtage enten

• Denosumab s.c. injektion 60 mg x1, eller
• Placebo, natriumchlorid s.c. injektion x 1

Alle deltagere afleverer sædprøver, blodprøver og får foretaget DXA-scanning før og efter intervention. Alle får tilskud med D-vitamin og calcium for at undgå hypocalcæmi, en kendt, forbigående bivirkning til Denosumab.

*dobbeltblindede undersøgelser kræver, at placebo og det aktive stof er identiske. Placebo kan kun fås fra Amgen, og vi var ikke i stand til at modtage eller købe placebo. I stedet vil undersøgelsen være dobbeltblindet for patienter, læger og alle, der deltager i datahåndtering og analyser - kun én sygeplejerske, der giver medicinen, vil blive afblindet. Hun vil vide, om hun injicerer aktivt stof eller placebo.

Inklusionskriterier

• Mænd > 18 år henvist grundet barnløshed med behov for yderligere udredning med
• Spermkoncentration ≥ 0,05 mio./ml.
• Spermkoncentration <15 mio./ml eller
• <40 % motile spermatozoer (ABC) eller
• <4 % morfologisk normale sædceller (strenge kriterier)

Eksklusionskriterier

• Mænd med kroniske sygdomme (diabetes mellitus, skjoldbruskkirtelsygdom, endokrine sygdomme, der kræver behandling, ondartede sygdomme eller sygdomme, der vides at være påvirket af eller forstyrrer D-vitamintilskud (granulomatøse sygdomme som sarkoidose, tuberkulose, wegeners, vaskulitis samt inflammatoriske tarmsygdomme) f.eks. chrons sygdom eller colitis ulcerosa osv.).
• Mænd med aktiv eller tidligere malign sygdom
• Ethvert tilfælde med indikation for testikelbiopsi,
• Total calcium < 2,14 mmol/l
• 25-OH D-vitamin < 25 nmol/L
• Dårlig tandstatus eller tandimplantater
• Mænd med obstruktiv oligospermi eller som er blevet vasektomiseret
• Seruminhibin B < 30 pg/ml
• Unormal karyotype
• Patienter, der udøver overdreven motion

PRØVESTØRRELSE BEREGNING OG STATISTIK

Med et testniveau på 5 % (signifikansniveau), en styrke på 80 % og 40 mænd i hver gruppe vil vi være i stand til at påvise en ændring i det samlede antal bevægelige sædceller på 75 % og en ændring i sædkoncentrationen (indekseret til basisværdi) på 25 %.

Vi forventer at medtage i alt 95 mand, for at tage højde for muligheden for frafald. Dette svarer til et frafald på 10 %, i tilfælde af at andelen er lavere, vil chancerne for at opdage en signifikant forskel være over 80 %.

Da vi forventer, at 50 % af alle infertile mænd i ambulatoriet opfylder inklusionskriterier og 50 % af disse giver samtykke til deltagelse, forventer vi screening af 380 mænd i alt.

BIOSTATISTISK ANALYSE

Alle analyserne vil blive udført i henhold til retningslinjerne for god klinisk praksis og de primære analyser i intention-to-treat-populationen, som omfattede alle patienter, der blev randomiseret og fik den første dosis medicin på dag 1. Vi analyserer dataene på 2 måder. Den primære analyse vil forløbe i henhold til den randomiserede gruppeopgave. Den sekundære analyse vil være baseret på at stratificere mændene efter undergruppeanalyser i forhold til de foruddefinerede primære og sekundære endepunkter.

De primære endepunkter for denne protokol vil være ændringer i sædproduktionen vurderet ud fra: total bevægelige spermatozoer (106), totale progressive bevægelige spermatozoer (106), total spermatozoer (106) eller sædkoncentration (106/ml). På grund af den lave prøvestørrelse og store intraindividuelle variation i sædproduktion vil primære endepunkter også blive evalueret efter normalisering til det gennemsnitlige gennemsnitlige niveau før interventionen. Baseret på den første intervention anslås det, at 60% af mændene vil have gavn af behandlingen, og denne undersøgelse er designet til at bestemme, om serum OPG, RANKL eller fosfat kan bruges til at identificere mænd, der vil have gavn af behandlingen. Brugen af ​​disse specificerede endepunkter vil være nyttig til at bestemme effektiviteten. Der findes flere sekundære endepunkter, men for den indledende undersøgelse vil fokus være på: Sperm DFI, morfologi, motilitet, sædvolumen, graviditetsrate, Inhibin B, D-vitamin og calciumhomeostase. Forsøgspersoner, der afslutter deltagelsen efter besøg efter 80 dage, men før besøgsdag 160, vil blive inkluderet til dataanalyse op til dag 80. Mænd, der kun afgiver én sædprøve eller mangler data ved ethvert besøg, vil stadig blive inkluderet i analysen. Mænd med feber op til 3 måneder før sædanalyse vil blive betragtet som en potentiel konfounder. Disse værdier vil derefter blive videreført til analyser. Der anvendes et signifikansniveau på 5 %. Til de primære analyser beregnes Bonferroni-Holm p-værdi korrektion yderligere. Til den sekundære analyse anvendes ingen multiple testkorrektion. I stedet diskuteres resultaterne i lyset af de mange testsituationer.

1. Analyser mellem placebo versus aktivt stof: Det første skridt vil være at sammenligne ændringerne i primære resultater på tværs af de to grupper. Denne analyse vil vise, om der er en signifikant forskel mellem grupperne. For alle endepunkter målt ved baseline og dag 80 og 160, vil parrede t-tests blive brugt til at vurdere, om der er en signifikant forskel mellem grupperne og bestemme, om den gennemsnitlige ændring inden for hver gruppe adskiller sig signifikant fra nul. I begge tilfælde vil data blive transformeret efter behov for at opfylde modellens antagelser. På grund af formodede forskelle i varighed af abstinens vil de samme analyser blive udført efter udelukkelse af mænd med varighed <48 timer før eller efter 80 dages behandling. Bagefter vil den indledende analyse blive udført ved at bruge multipel regression med relevante konfoundere som sæson, BMI, rygning, alder, varighed af abstinens, tid fra ejakulation til motilitetsvurdering, feber etc. for at se, om dette ændrer resultaterne. For målte resultater, som ikke kan sammenlignes med t-test eller andre parametriske test på dag 1, dag 80 og dag 160, vil grupper blive sammenlignet ved hjælp af ikke-parametriske tests såsom Wilcoxon Mann-Whitney test. For binært udfald vil dataene blive sammenlignet mellem de to grupper ved hjælp af betinget logistisk-regressionsanalyse med justering for relevante konfoundere (defineret som værende signifikant p<0,05 associeret). For udfald målt gentagne gange vil dette indebære sammenligning af de estimerede hældninger eller ændringsrater for hvert udfald mellem grupperne. Blandede modeller muliggør, at korrelationen mellem de gentagne observationer baseline-dag 1-dag 80-dag 160 fra hver mand kan inkorporeres passende i parameterestimering. Sædproduktionsvariabler vil blive normaliseret til baseline niveauer for at undgå den enorme interindividuelle variation i sædtal og sædkoncentration
2. Undergruppeanalyse vil være væsentlig i denne undersøgelse, fordi vi forventer, at omkring 60 % af mændene vil have gavn af behandling med Denosumab. Analyser efter stratificering i undergrupper vil derfor blive brugt til at identificere en markør til udvælgelse af de mænd, der vil have gavn af behandlingen. Forsøgspersonerne vil blive grupperet efter deres serum OPG og/eller RANKL, RANKL/OPG ratio, deres DNA-fragmentation-Index før kl. starten af ​​intervention. Bagefter vil andre potentielle prædiktorer for behandlingsrespons blive testet, såsom BMI, S-calcium, s-phosphat, BMD, sædkvalitet, Inhibin b, FSH på dag 80 og dag 160. For serum OPG kunne en sådan stratificering være i to grupper adskilt af f.eks. 3 pg/ml eller tre grupper, <3, 3-4 og over 4 pg/ml. Ligeledes for RANKL og RANKL/OPG ratio og for DNA-fragmentering-Index-stratificering kunne også være i to grupper adskilt af f.eks. DFI på 40 pct. Undergruppeanalyserne vil være i overensstemmelse med normal klinisk praksis og stratificering i passende grupper efter de kliniske eller højeste/laveste grupper.

SCREENING OG TIDSKURSE

Undersøgelsen påbegyndes januar 2017 og slutter, når den sidste person er inkluderet senest januar 2021.

RESULTATMÅLING

Slutpunkter:

Primære endepunkter

• Ændring i sædproduktionen (totale bevægelige spermatozoer, progressive bevægelige spermatozoer, sædtal, sædkoncentration)

Sekundære endepunkter

• Ændring i sædkvalitet (-motilitet, -morfologi, sædvolumen)
• Ændring i DNA-fragmenteringshastighed (DFI) i sædceller
• Ændring i serum Inhibin-B
• Ændring i serumniveauer af reproduktive hormoner (FSH, LH, AMH, testosteron, østradiol og SHBG)
• Ændring i serumprolaktinniveau
• Ændring i fastende glukoseniveau
• Ændring i fastin insulin niveau
• Ændring i c-peptid
• Ændring i HbA1c
• Ændring i lipidprofil
• Ændring i knoglemineraltæthed vurderet af DXA.
• Ændring i serumniveau af inaktivt vitamin D, 1,25(OH)2D3, 25-OHD3, 24,25(OH)2D3, PTH, alkalisk fosfatase, ioniseret calcium, fosfat, FGF23, Klotho, osteocalcin, matrix gla, osteopontin, calcitonin, pnp, procollagen III, OPG, RANKL, Sclerostin samt anden knoglemarkør.
• Ændring i valg af assisteret reproduktionsassistance teknik samt undfangede graviditeter
• Ændring i spontan undfangelsesrate
• Ændring i levende fødselsrate
• Ændring i antallet af spermatozoer, der udtrykker RANKL
• Ændring i sæd pH, HCO3-, calcium, zink, fosfat, RANKL, RANK, OPG, FGF23, Klotho, osteocalcin, osteopontin. VDB, 24,25OH2
• Forskel i infektionsrate i de to grupper

INDSTILLING, VIDENSKABELIG PLAN OG REKRUTTERING

Deltagerne vil indgå blandt mænd, der henvises til Afdeling for Vækst og Reproduktion (GR), Rigshospitalet (RH) til vurdering af mandlig infertilitet

Dette er et prospektivt, dobbeltblindet, to-armet randomiseret kontrolleret forsøg. Interventionsgruppe: Hver mand vil modtage Denosumab 60 mg x 1 sc kun på dag 1 Gruppe, der modtager placebo: Følger den samme hændelseskæde, selvom Denosumab vil blive erstattet med saltvand

Alle mænd vil blive tilbudt det samme D-vitamin- og calciumtilskud startende før påbegyndelse af behandlingsstart af Denosumab eller placebo: D-vitamin 15 mikrogram og calcium 400 mg én gang dagligt.

DELTAGERE

Der vil blive udført screening af ~500 infertile mænd. Efterforskerne antager, at ~300 mænd vil blive udelukket, og ~100 mænd ikke ønsker at deltage. Således vil 95 mænd indgå i undersøgelsen, og halvdelen vil blive randomiseret til aktiv behandling. Efterforskerne forventer et lille frafald (<5) på grund af høj motivation og ingen bivirkninger.

ANALYSE OG INTERVENTION

Reproduktionshormoner og sæd vil blive analyseret på afd. af GR, Rigshospitalet.

ETIK OG BIVIRKNINGER

Alle patienter vil have fuldført deres undersøgelse, før de inviteres til undersøgelsen. De vil blive informeret om potentielle bivirkninger, og de kan forlade forsøget på ethvert tidspunkt uden konsekvenser.

Denosumab har vist sig at være sikkert i flere randomiserede undersøgelser og er allerede godkendt af både FDA og EMA. Alle bivirkninger vil blive nøje overvåget, registreret og i tilfælde af enten uventet hyppighed af bivirkninger eller uventede kliniske komplikationer vil det blive offentliggjort.

Baseret på tidligere fertilitetsundersøgelser på vores afdeling forventer vi, at en stor del af de ambulante patienter ønsker at deltage. Efter vores vurdering er det skitserede studie etisk forsvarligt, og vi mener, at det er nødvendigt med randomiserede kliniske forsøg for at kunne generere fremtidige anbefalinger.

OFFENTLIGGØRELSE AF RESULTATER

Alle resultater, positive eller negative, vil blive indsendt til peer reviewed videnskabelige tidsskrifter. Data vil successivt blive indhentet og overført til en statistisk database.