Denosumab und männliche Unfruchtbarkeit: eine RCT

EINFÜHRUNG

Unfruchtbarkeit ist ein ernstes Problem, von dem schätzungsweise 7-26 % aller Paare weltweit betroffen sind (1;2). Etwa 9 % aller Neugeborenen wurden 2013 in Dänemark durch Techniken der assistierten Reproduktion gezeugt (Danish Fertility Society). Eine beeinträchtigte Samenqualität ist in fast 50 % aller Fälle von Unfruchtbarkeit der ursächliche oder beitragende Faktor (3;4). Heutzutage gibt es keine Behandlungen, die die Samenqualität der meisten unfruchtbaren Männer verbessern können. Stattdessen wird die überwiegende Mehrheit unfruchtbarer Paare mit assistierten Reproduktionstechniken (ART) behandelt, unabhängig von der Ätiologie (mütterlich/väterlich), die die Unfruchtbarkeit verursacht (3;5-8). Die Behandlungsauswahl reicht von milder intrauteriner Insemination (IUI) bis hin zu invasiverer In-vitro-Fertilisation (IVF) oder intrazytoplasmatischer Spermieninjektion (ICSI). ART ist bei über 70 % aller Paare erfolgreich. ART ist jedoch sehr teuer und aufgrund der invasiven Methodik und der Notwendigkeit einer Hormonbehandlung, oft über mehrere Monate, mit mütterlichen Nebenwirkungen verbunden (9-11). Unfruchtbarkeit ist auch eine finanzielle Belastung für die Gesellschaft aufgrund der Kosten der ART, um eine akzeptable jährliche Geburtenrate aufrechtzuerhalten.

Das durch die Samenqualität bestimmte Fruchtbarkeitspotenzial wird bereits als Fötus festgelegt (12). Entwickeln sich die Hoden nicht normal, ist eine verminderte Samenqualität im Erwachsenenalter die Folge einer gestörten Funktion der Sertoli-Zellen. Bis heute ist kaum untersucht worden, ob ein Eingriff im Erwachsenenalter die Samenqualität verbessern kann.

Unsere jüngsten Studien mit menschlichen Hoden und Vitamin-D-Rezeptor-Knockout-Mäusen zeigten, dass der Vitamin-D-regulierte Knochenfaktor RANKL in den Hoden exprimiert wird (13;14). Dies ist ein neuer Befund, da bisher nur bekannt war, dass RANKL die Knochenhomöostase beeinflusst und in gewissem Umfang das Immunsystem, Entzündungen und die Laktation beeinflusst (15;16). Im Skelett wird RANKL in Osteoblasten exprimiert und bindet an seinen spezifischen Rezeptor RANK in Osteoklasten, um Osteoklastogenese und Knochenresorption zu induzieren (17). Diese Aktivierung wird durch Osteoprotegerin (OPG) kontrolliert, das an die Ligandendomäne von RANKL bindet und somit die RANK-Aktivierung und Osteoklastogenese hemmt, wodurch letztendlich die Knochenresorption reduziert wird (18). Dieses Wissen wurde für die Entwicklung eines OPG-Analog-Medikaments genutzt, eines rekombinanten humanen monoklonalen IGg2-Antikörpers Denosumab (Prolia von Amgen), der RANKL und damit die Knochenresorption hemmt und sowohl zur Anwendung bei Osteoporose als auch bei Knochenmetastasen indiziert ist (19;20). . Prolia hat sich in mehreren klinischen Studien als sicher erwiesen und ist zur Behandlung von Osteoporose bei Männern und Frauen zugelassen (21-24). Neuere Daten weisen darauf hin, dass RANKL/OPG möglicherweise an der Regulierung der Pankreasfunktion, der Insulin- und Glukagonproduktion beteiligt ist, was eine mögliche indirekte Wirkung auf die Reproduktion durch die Knochen-Pankreas-Gonaden-Achse unterstützt.

ZIEL DES STUDIUMS

Um die Bedeutung der systemischen RANKL-Hemmung für die männliche Reproduktion zu bestimmen, indem untersucht wird, ob Denosumab (Prolia) die Samenqualität erhöhen kann, und insbesondere um die Gruppe von Männern zu identifizieren, die von der Behandlung profitieren werden.

DESIGN

Einzelzentrische, prospektiv randomisierte, doppelblinde* klinisch kontrollierte Intervention.

Patienten und Methoden:

95 unfruchtbare Männer, ansonsten gesund, werden unter den Männern rekrutiert, die zur Untersuchung auf Unfruchtbarkeit in die Ambulanz des Dpt. von Wachstum und Fortpflanzung, Rigshopitalet. Weder die Entscheidung zur Teilnahme noch die Ablehnung haben Auswirkungen auf die weitere ambulante Behandlung.

Die 95 Teilnehmer werden nach dem Zufallsprinzip entweder zugeteilt

• Denosumab s.c. Injektion 60 mg x1, oder
• Placebo, Natriumchlorid s.c. Einspritzung x 1

Alle Teilnehmer liefern Samenproben, Blutproben und lassen vor und nach dem Eingriff einen DXA-Scan durchführen. Alle erhalten Nahrungsergänzungsmittel mit Vitamin D und Kalzium, um eine Hypokalzämie, eine bekannte vorübergehende Nebenwirkung von Denosumab, zu vermeiden.

*Doppelblindstudien erfordern, dass Placebo und Wirkstoff identisch sind. Placebo ist nur von Amgen erhältlich und wir konnten kein Placebo erhalten oder kaufen. Stattdessen wird die Studie gegenüber Patienten, Ärzten und allen, die an der Datenverarbeitung und -analyse beteiligt sind, doppelt verblindet sein – nur eine Krankenschwester, die das Medikament verabreicht, wird entblindet. Sie wird wissen, ob sie Wirkstoff oder Placebo spritzt.

Einschlusskriterien

• Männer > 18 Jahre, die aufgrund von Unfruchtbarkeit zur weiteren Untersuchung überwiesen werden
• Spermienkonzentration ≥ 0,05 Mio./ml.
• Spermienkonzentration <15 Mio./ml bzw
• <40 % bewegliche Spermien (ABC) oder
• <4 % morphologisch normale Spermien (strenge Kriterien)

Ausschlusskriterien

• Männer mit chronischen Erkrankungen (Diabetes mellitus, Schilddrüsenerkrankungen, behandlungsbedürftigen endokrinen Erkrankungen, bösartigen Erkrankungen oder Erkrankungen, die bekanntermaßen durch Vitamin-D-Präparate beeinflusst oder beeinträchtigt werden (granulomatöse Erkrankungen wie Sarkoidose, Tuberkulose, Wegener, Vaskulitis sowie entzündliche Darmerkrankungen). z.B. Chron-Krankheit oder Colitis ulcerosa usw.).
• Männer mit aktiver oder früherer bösartiger Erkrankung
• Jeder Fall mit Indikation zur Hodenbiopsie,
• Gesamtkalzium < 2,14 mmol/l
• 25-OH-Vitamin D < 25 nmol/l
• Schlechter Zahnstatus oder Zahnimplantate
• Männer mit obstruktiver Oligospermie oder Vasektomie
• Serum-Inhibin B < 30 pg/ml
• Abnormer Karyotyp
• Patienten, die sich übermäßig körperlich betätigen

BERECHNUNG DER PROBENGRÖSSE UND STATISTIK

Bei einem Testlevel von 5 % (Signifikanzniveau), einer Power von 80 % und 40 Männern in jeder Gruppe werden wir in der Lage sein, eine Veränderung der Gesamtzahl beweglicher Spermien von 75 % und eine Veränderung der Spermienkonzentration (indiziert zum Ausgangswert) von 25 %.

Wir rechnen mit insgesamt 95 Männern, um mögliche Ausfälle zu berücksichtigen. Dies entspricht einer Dropout-Rate von 10 %, falls die Rate niedriger ist, liegen die Chancen, einen signifikanten Unterschied zu entdecken, bei über 80 %.

Da wir davon ausgehen, dass 50 % aller unfruchtbaren Männer in der Ambulanz die Einschlusskriterien erfüllen und davon 50 % der Teilnahme zustimmen, rechnen wir mit einem Screening von insgesamt 380 Männern.

BIOSTATISTISCHE ANALYSE

Alle Analysen werden gemäß den Leitlinien der Guten Klinischen Praxis und den Primäranalysen in der Intention-to-Treat-Population durchgeführt, die alle Patienten umfasste, die sich einer Randomisierung unterzogen und am Tag 1 die erste Dosis des Arzneimittels erhalten hatten. Wir werden die Daten auf zwei Arten analysieren. Die Primäranalyse wird gemäß der randomisierten Gruppenzuordnung durchgeführt. Die Sekundäranalyse basiert auf der Stratifizierung der Männer nach Subgruppenanalysen in Bezug auf die vordefinierten primären und sekundären Endpunkte.

Die primären Endpunkte für dieses Protokoll sind Veränderungen in der Spermienproduktion, bewertet durch: gesamte bewegliche Spermien (106), gesamte progressive bewegliche Spermien (106), gesamte Spermien (106) oder Spermienkonzentration (106/ml). Aufgrund der geringen Stichprobengröße und der großen intraindividuellen Variation der Spermienproduktion werden die primären Endpunkte auch nach Normalisierung auf das mittlere Durchschnittsniveau vor der Intervention bewertet. Basierend auf der ersten Intervention werden schätzungsweise 60 % der Männer von der Behandlung profitieren, und diese Studie soll bestimmen, ob Serum-OPG, RANKL oder Phosphat verwendet werden können, um Männer zu identifizieren, die von der Behandlung profitieren. Die Verwendung dieser spezifizierten Endpunkte ist für die Bestimmung der Wirksamkeit nützlich. Es gibt mehrere sekundäre Endpunkte, aber für die anfängliche Untersuchung liegt der Schwerpunkt auf: DFI der Spermien, Morphologie, Beweglichkeit, Samenvolumen, Schwangerschaftsrate, Inhibin B, Vitamin D und Kalziumhomöostase. Probanden, die die Teilnahme nach dem Besuch am 80. Tag, aber vor dem Besuchstag 160 beenden, werden für die Datenanalyse bis zum 80. Tag eingeschlossen. Männer, die nur eine Samenprobe abgeben oder bei einem Besuch fehlende Daten haben, werden dennoch in die Analyse einbezogen. Männer mit Fieber bis zu 3 Monate vor der Samenanalyse werden als potenzieller Confounder betrachtet. Diese Werte werden dann für Analysen übernommen. Es wird ein Signifikanzniveau von 5 % verwendet. Für die Primäranalysen wird zusätzlich eine p-Wert-Korrektur nach Bonferroni-Holm berechnet. Für die Sekundäranalyse werden keine multiplen Testkorrekturen verwendet. Stattdessen werden die Ergebnisse im Hinblick auf die vielfältigen Testsituationen diskutiert.

1. Analysen zwischen Placebo und Wirkstoff: Der erste Schritt besteht darin, die Veränderungen der primären Endpunkte zwischen den beiden Gruppen zu vergleichen. Diese Analyse wird zeigen, ob es einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen gibt. Für alle zu Studienbeginn und Tag 80 und 160 gemessenen Endpunkte werden gepaarte t-Tests verwendet, um zu beurteilen, ob es einen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen gibt, und um zu bestimmen, ob die mittlere Veränderung innerhalb jeder Gruppe signifikant von Null abweicht. In beiden Fällen werden die Daten nach Bedarf transformiert, um die Modellannahmen zu erfüllen. Aufgrund angenommener Unterschiede in der Abstinenzdauer werden die gleichen Analysen nach Ausschluss von Männern mit einer Dauer < 48 Stunden vor oder nach 80 Tagen Behandlung durchgeführt. Anschließend erfolgt eine initiale Analyse mittels multipler Regression mit relevanten Confoundern wie Jahreszeit, BMI, Rauchen, Alter, Dauer der Abstinenz, Zeit von der Ejakulation bis zur Motilitätsbeurteilung, Fieber etc., um zu sehen, ob dies die Ergebnisse verändert. Für gemessene Ergebnisse, die an Tag 1, Tag 80 und Tag 160 nicht mit dem t-Test oder anderen parametrischen Tests verglichen werden können, werden die Gruppen mit nicht-parametrischen Tests wie dem Wilcoxon-Mann-Whitney-Test verglichen. Für das binäre Ergebnis werden die Daten zwischen den beiden Gruppen mittels bedingter logistischer Regressionsanalyse mit Anpassung für relevante Confounder (definiert als signifikant p < 0,05 assoziiert) verglichen. Für Ergebnisse, die wiederholt gemessen werden, bedeutet dies, dass die geschätzten Steigungen oder Änderungsraten jedes Ergebnisses zwischen den Gruppen verglichen werden. Gemischte Modelle ermöglichen, dass die Korrelation zwischen den wiederholten Beobachtungen Basislinie – Tag 1 – Tag 80 – Tag 160 von jedem Mann in geeigneter Weise in die Parameterschätzung einbezogen wird. Die Variablen der Spermienproduktion werden auf die Ausgangswerte normalisiert, um die große interindividuelle Variation der Spermienzahl und Spermienkonzentration zu vermeiden
2. Eine Subgruppenanalyse wird in dieser Studie unerlässlich sein, da wir davon ausgehen, dass etwa 60 % der Männer von einer Behandlung mit Denosumab profitieren werden. Analysen nach der Stratifizierung in Untergruppen werden daher verwendet, um einen Marker zur Auswahl der Männer zu identifizieren, die von der Behandlung profitieren. Die Probanden werden nach ihrem Serum-OPG und/oder RANKL, RANKL/OPG-Verhältnis, ihrem DNA-Fragmentierungsindex vor gruppiert Beginn der Intervention. Danach werden andere potenzielle Prädiktoren für das Ansprechen auf die Behandlung getestet, wie BMI, S-Calcium, S-Phosphat, BMD, Samenqualität, Inhibin b, FSH an Tag 80 und Tag 160. Für Serum-OPG könnte eine solche Schichtung in zwei Gruppen erfolgen, die beispielsweise durch 3 pg/ml getrennt sind, oder in drei Gruppen, < 3, 3–4 und über 4 pg/ml. Ebenso könnte für RANKL und das RANKL/OPG-Verhältnis und für den DNA-Fragmentierungsindex eine Stratifizierung auch in zwei Gruppen erfolgen, die z. DFI von 40 %. Die Untergruppenanalysen erfolgen in Übereinstimmung mit der normalen klinischen Praxis und der Stratifizierung in geeignete Gruppen entsprechend den klinischen oder höchsten/niedrigsten Gruppen.

SCREENING UND ZEITVERLAUF

Die Studie wird im Januar 2017 begonnen und endet, wenn die letzte Person eingeschlossen wurde, spätestens im Januar 2021.

ERGEBNISMESSUNGEN

Endpunkte:

Primäre Endpunkte

• Veränderung der Spermienproduktion (gesamt bewegliche Spermien, progressive bewegliche Spermien, Spermienzahl, Spermienkonzentration)

Sekundäre Endpunkte

• Veränderung der Samenqualität (-Motilität, -Morphologie, Samenvolumen)
• Änderung der DNA-Fragmentierungsrate (DFI) in Spermien
• Veränderung des Serum-Inhibin-B
• Veränderung der Serumspiegel von Fortpflanzungshormonen (FSH, LH, AMH, Testosteron, Östradiol und SHBG)
• Veränderung des Serumprolaktinspiegels
• Änderung des Nüchternglukosespiegels
• Veränderung des Fastin-Insulinspiegels
• Veränderung des c-Peptids
• Veränderung des HbA1c
• Veränderung des Lipidprofils
• Veränderung der Knochenmineraldichte, bewertet durch DXA.
• Veränderung des Serumspiegels von inaktivem Vitamin D, 1,25(OH)2D3, 25-OHD3, 24,25(OH)2D3, PTH, alkalischer Phosphatase, ionisiertem Calcium, Phosphat, FGF23, Klotho, Osteocalcin, Matrix gla, Osteopontin, Calcitonin, pnp, Prokollagen III, OPG, RANKL, Sclerostin sowie andere Knochenmarker.
• Änderung der Wahl der Technik der assistierten Reproduktionshilfe sowie empfangene Schwangerschaften
• Änderung der spontanen Empfängnisrate
• Veränderung der Lebendgeburtenrate
• Änderung der Anzahl der Spermien, die RANKL exprimieren
• Veränderung des Samen-pH, HCO3-, Calcium, Zink, Phosphat, RANKL, RANK, OPG, FGF23, Klotho, Osteocalcin, Osteopontin. VDB, 24,25OH2
• Unterschied in der Infektionsrate in den beiden Gruppen

EINSTELLUNG, WISSENSCHAFTLICHER PLAN UND EINSTELLUNG

Die Teilnehmer werden zu den Männern gezählt, die zur Beurteilung der männlichen Unfruchtbarkeit an die Abteilung für Wachstum und Reproduktion (Abteilung GR) des Rigshospitalet (RH) überwiesen werden

Dies ist eine prospektive, doppelblinde, zweiarmige, randomisierte, kontrollierte Studie. Interventionsgruppe: Jeder Mann erhält Denosumab 60 mg x 1 s.c. nur an Tag 1. Gruppe, die Placebo erhält: Wird der gleichen Kette von Ereignissen folgen, obwohl Denosumab durch Kochsalzlösung ersetzt wird

Allen Männern wird die gleiche Vitamin-D- und Calcium-Ergänzung angeboten, beginnend vor Beginn der Behandlung mit Denosumab oder Placebo: Vitamin D 15 Mikrogramm und Calcium 400 mg einmal täglich.

TEILNEHMER

Es wird ein Screening von etwa 500 unfruchtbaren Männern durchgeführt. Die Ermittler gehen davon aus, dass ~300 Männer ausgeschlossen werden und ~100 Männer nicht teilnehmen wollen. Somit werden 95 Männer in die Studie aufgenommen und die Hälfte wird randomisiert einer aktiven Behandlung zugeteilt. Die Prüfärzte rechnen aufgrund der hohen Motivation und ohne Nebenwirkungen mit einem kleinen Drop-out (<5).

ANALYSE UND INTERVENTION

Reproduktionshormone und Sperma werden in der Abt. analysiert. von GR, Rigshospitalet.

ETHIK UND NEBENWIRKUNGEN

Alle Patienten haben ihre Untersuchung abgeschlossen, bevor sie zur Studie eingeladen werden. Sie werden über mögliche Nebenwirkungen informiert und können die Studie jederzeit ohne Konsequenzen verlassen.

Denosumab hat sich in mehreren randomisierten Studien als sicher erwiesen und ist bereits sowohl von der FDA als auch von der EMA zugelassen. Alle Nebenwirkungen werden genau überwacht, registriert und im Falle einer unerwarteten Häufigkeit von Nebenwirkungen oder unerwarteten klinischen Komplikationen veröffentlicht.

Basierend auf früheren Fertilitätsstudien an unserer Abteilung erwarten wir, dass ein großer Teil der ambulanten Patienten teilnehmen möchte. Unserer Meinung nach ist die skizzierte Studie ethisch einwandfrei, und wir glauben, dass randomisierte klinische Studien notwendig sind, um zukünftige Empfehlungen zu generieren.

VERÖFFENTLICHUNG DER ERGEBNISSE

Alle Ergebnisse, ob positiv oder negativ, werden bei von Experten begutachteten wissenschaftlichen Zeitschriften eingereicht. Die Daten werden sukzessive erhoben und in eine statistische Datenbank übertragen.