Denosumab og mannlig infertilitet: en RCT

INTRODUKSJON

Infertilitet er et alvorlig problem som anslås å påvirke 7-26 % av alle par globalt (1;2). Omtrent 9 % av alle nyfødte ble unnfanget ved assistert befruktning i 2013 i Danmark (Dansk Fertilitetsforening). Nedsatt sædkvalitet er årsak eller medvirkende faktor i nesten 50 % av alle tilfeller av infertilitet (3;4). I dag finnes det ingen behandlinger som kan forbedre sædkvaliteten til de fleste infertile menn. I stedet behandles det store flertallet av infertile par med assistert befruktning (ART) uavhengig av etiologien (mor/far) som forårsaker infertiliteten (3;5-8). Behandlingsvalget spenner fra milde intrauterine inseminasjoner (IUI) til mer invasiv in vitro fertilisering (IVF) eller intracytoplasmatisk spermieinjeksjon (ICSI). ART er vellykket for mer enn 70 % av alle par. ART er imidlertid svært kostbart og forbundet med maternelle bivirkninger på grunn av den invasive metodikken og behovet for hormonbehandling, ofte i flere måneder (9-11). Infertilitet er også en økonomisk belastning for samfunnet på grunn av kostnadene ved ART for å opprettholde en akseptabel årlig fødselsrate.

Fertilitetspotensial bestemt av sædkvalitet er etablert allerede som foster (12). I tilfelle testiklene ikke utvikler seg normalt, vil redusert sædkvalitet i voksen alder være resultatet som følge av nedsatt Sertoli-cellefunksjon. Frem til i dag har det knapt vært undersøkt om intervensjon i voksen alder kan forbedre sædkvaliteten.

Våre nylige studier med bruk av både humane testis og vitamin D-reseptor knock-out mus avslørte at den vitamin D regulerte beinfaktoren RANKL kommer til uttrykk i testiklene (13;14). Dette er et nytt funn, fordi RANKL til nå kun har vært kjent for å påvirke benhomeostase og til en viss grad påvirke immunsystemet, betennelser og amming (15;16). I skjelettet kommer RANKL til uttrykk i osteoblaster og binder seg til sin spesifikke reseptor RANK i osteoklaster for å indusere osteoklastogenese og benresorpsjon (17). Denne aktiveringen styres av osteoprotegerin (OPG), som binder seg til liganddomenet til RANKL og dermed hemmer RANK-aktivering og osteoklastogenese, og til slutt reduserer benresorpsjonen (18). Denne kunnskapen har blitt utnyttet til utvikling av et OPG-analogt medikament, et rekombinant humant monoklonalt IGg2-antistoff Denosumab (Prolia by Amgen), som hemmer RANKL og dermed benresorpsjon og er indisert for bruk ved både osteoporose og benmetastaser (19;20) . Prolia har i flere kliniske studier vist seg å være trygge og er godkjent som behandling for osteoporose hos både menn og kvinner (21-24). Nyere data indikerer at RANKL/OPG kan være involvert i regulering av bukspyttkjertelfunksjon, insulin og glukagonproduksjon som støtter en mulig indirekte effekt på reproduksjon gjennom ben-pankreas-gonadal akse.

MÅL MED STUDIE

For å bestemme betydningen av systemisk RANKL-hemming for mannlig reproduksjon ved å undersøke om Denosumab (Prolia) kan øke sædkvaliteten og spesielt å identifisere gruppen menn som vil ha nytte av behandlingen.

DESIGN

Enkeltsenter, prospektiv randomisert dobbeltblindet* klinisk kontrollert intervensjon.

Pasienter og metoder:

95 infertile menn, ellers friske, skal rekrutteres blant menn henvist til utredning for infertilitet ved poliklinikken ved Dpt. for vekst og reproduksjon, Rigshopitalet. Verken å velge å delta, eller å takke nei, vil påvirke videre poliklinikkbehandling.

De 95 deltakerne er tilfeldig fordelt på å motta enten

• Denosumab s.c. injeksjon 60 mg x1, eller
• Placebo, natriumklorid s.c. injeksjon x 1

Alle deltakerne leverer sædprøver, blodprøver og får utført DXA-skanning før og etter intervensjon. Alle får tilskudd med vitamin D og kalsium for å unngå hypokalsemi, en kjent, forbigående bivirkning av Denosumab.

*dobbelblindede studier krever at placebo og virkestoffet er identiske. Placebo kan kun fås fra Amgen, og vi var ikke i stand til å motta eller kjøpe placebo. I stedet vil studien være dobbeltblindet for pasienter, leger og alle som deltar i datahåndtering og analyser - kun én sykepleier som gir medisinen vil bli deblindet. Hun vil vite om hun injiserer aktivt stoff eller placebo.

Inklusjonskriterier

• Menn > 18 år henvist pga infertilitet med behov for videre utredning med
• Spermkonsentrasjon ≥ 0,05 mio./ml.
• Spermkonsentrasjon <15 mio./ml eller
• <40 % motile spermatozoer (ABC) eller
• <4 % morfologisk normale sædceller (strenge kriterier)

Eksklusjonskriterier

• Menn med kroniske sykdommer (diabetes mellitus, skjoldbruskkjertelsykdom, endokrine sykdommer som krever behandling, ondartede sykdommer eller sykdommer som er kjent for å være påvirket av eller forstyrrer vitamin D-tilskudd (granulomatøse sykdommer som sarkoidose, tuberkulose, wegeners, vaskulitt samt inflammatoriske tarmsykdommer f.eks. chrons sykdom eller ulcerøs kolitt osv.).
• Menn med aktiv eller tidligere ondartet sykdom
• Ethvert tilfelle med indikasjon for testisbiopsi,
• Totalt kalsium < 2,14 mmol/l
• 25-OH Vitamin D < 25 nmol/L
• Dårlig tannstatus eller tannimplantater
• Menn med obstruktiv oligospermi eller som har blitt vasektomisert
• Seruminhibin B < 30 pg/ml
• Unormal karyotype
• Pasienter som trener overdreven trening

PRØVESTØRRELSE BEREGNING OG STATISTIKK

Med et testnivå på 5 % (signifikansnivå), en styrke på 80 % og 40 menn i hver gruppe vil vi kunne oppdage en endring i totalt antall bevegelige spermier på 75 %, og en endring i spermkonsentrasjon (indeksert til grunnlinjeverdi) på 25 %.

Vi regner med å inkludere totalt 95 mann, for å ta hensyn til muligheten for frafall. Dette tilsvarer et frafall på 10 %, i tilfelle frekvensen er lavere vil sjansene for å oppdage en signifikant forskjell være over 80 %.

Siden vi forventer at 50 % av alle infertile menn i poliklinikken oppfyller inklusjonskriterier og 50 % av disse samtykker til deltakelse, regner vi med screening av totalt 380 menn.

BIOSTATISTISK ANALYSE

Alle analysene vil bli utført i henhold til retningslinjer for god klinisk praksis og primæranalysene i intention-to-treat-populasjonen, som inkluderte alle pasienter som gjennomgikk randomisering og fikk første dose medisin på dag 1. Vi vil analysere dataene på 2 måter. Primæranalysen vil fortsette i henhold til den randomiserte gruppeoppgaven. Sekundæranalysen vil være basert på å stratifisere mennene etter undergruppeanalyser i forhold til de forhåndsdefinerte primære og sekundære endepunktene.

De primære endepunktene for denne protokollen vil være endringer i sædproduksjonen evaluert av: totalt bevegelige spermatozoer (106), totale progressive bevegelige spermatozoer (106), total spermatozoer (106) eller spermakonsentrasjon (106/ml). På grunn av den lave prøvestørrelsen og store intraindividuelle variasjonen i spermproduksjon vil primære endepunkter også bli evaluert etter normalisering til gjennomsnittlig gjennomsnittsnivå før intervensjonen. Basert på den første intervensjonen anslås 60 % av mennene å ha nytte av behandlingen, og denne studien er designet for å bestemme om serum OPG, RANKL eller fosfat kan brukes til å identifisere menn som vil ha nytte av behandlingen. Bruken av disse spesifiserte endepunktene vil være nyttig for å bestemme effekt. Flere sekundære endepunkter eksisterer, men for den innledende undersøkelsen vil fokus være på: Sperm DFI, morfologi, motilitet, sædvolum, graviditetsrate, inhibin B, vitamin D og kalsiumhomeostase. Forsøkspersoner som avslutter deltakelse etter besøk etter 80 dager, men før besøksdag 160, vil bli inkludert for dataanalyse frem til dag 80. Menn som bare leverer én sædprøve eller som mangler data ved ethvert besøk vil fortsatt inkluderes i analysen. Menn med feber opptil 3 måneder før sædanalyse vil bli vurdert som en potensiell konfounder. Disse verdiene vil deretter bli videreført for analyser. Det benyttes et signifikansnivå på 5 %. For primæranalysene beregnes Bonferroni-Holm p-verdikorreksjon i tillegg. For den sekundære analysen brukes ingen multiple testkorreksjon. I stedet diskuteres resultatene i lys av de mange testsituasjonene.

1. Analyser mellom placebo versus virkestoff: Det første trinnet vil være å sammenligne endringene i primære utfall på tvers av de to gruppene. Denne analysen vil vise om det er en signifikant forskjell mellom gruppene. For alle endepunkter målt ved baseline og dag 80 og 160, vil parede t-tester bli brukt for å vurdere om det er en signifikant forskjell mellom gruppene og avgjøre om gjennomsnittlig endring innen hver gruppe skiller seg signifikant fra null. I begge tilfeller vil data transformeres etter behov for å møte modellens forutsetninger. På grunn av antatte forskjeller i varighet av abstinens vil de samme analysene bli utført etter ekskludering av menn med varighet <48 timer før eller etter 80 dagers behandling. Etterpå vil den innledende analysen bli utført ved å bruke multippel regresjon med relevante konfoundere som sesong, BMI, røyking, alder, varighet av abstinens, tid fra utløsning til motilitetsvurdering, feber etc. for å se om dette endrer resultatene. For målte utfall som ikke kan sammenlignes med t-test eller andre parametriske tester på dag 1, dag 80 og dag 160, vil grupper sammenlignes ved bruk av ikke-parametriske tester som Wilcoxon Mann-Whitney test. For binært utfall vil dataene bli sammenlignet mellom de to gruppene ved hjelp av betinget logistisk-regresjonsanalyse med justering for relevante konfoundere (definert som signifikant p<0,05 assosiert). For utfall målt gjentatte ganger, vil dette innebære å sammenligne de estimerte stigningene, eller endringsratene, for hvert utfall mellom gruppene. Blandede modeller tillater at korrelasjonen mellom de gjentatte observasjonene baseline-dag 1-dag 80-dag 160 fra hver mann kan være passende inkorporert i parameterestimering. Spermproduksjonsvariabler vil bli normalisert til baseline-nivåer for å unngå den enorme interindividuelle variasjonen i spermantall og spermkonsentrasjon
2. Undergruppeanalyse vil være avgjørende i denne studien fordi vi forventer at rundt 60 % av mennene vil ha nytte av behandling med Denosumab. Analyser etter stratifisering i undergrupper vil derfor bli brukt til å identifisere en markør for å velge menn som vil ha nytte av behandlingen. Forsøkspersonene vil bli gruppert i henhold til deres serum OPG og/eller RANKL, RANKL/OPG ratio, deres DNA-fragmenteringsindeks før kl. starten på intervensjonen. Etterpå vil andre potensielle prediktorer for behandlingsrespons bli testet som BMI, S-kalsium, s-fosfat, BMD, sædkvalitet, Inhibin b, FSH på dag 80 og dag 160. For serum OPG kan slik stratifisering være i to grupper atskilt med for eksempel 3 pg/ml eller tre grupper, <3, 3-4 og over 4 pg/ml. Likeledes kan for RANKL og RANKL/OPG-forhold og for DNA-fragmentering-indeksstratifisering også være i to grupper atskilt med f.eks. DFI på 40 %. Undergruppeanalysene vil være i samsvar med vanlig klinisk praksis og stratifisering i hensiktsmessige grupper etter klinisk eller høyeste/laveste grupper.

SCREENING OG TIDSKURS

Studien vil bli igangsatt januar 2017 og avsluttes når siste person er inkludert senest januar 2021.

RESULTATMÅLINGER

Endepunkter:

Primære endepunkter

• Endring i sædproduksjonen (totale bevegelige sædceller, progressive bevegelige sædceller, antall sædceller, sædkonsentrasjoner)

Sekundære endepunkter

• Endring i sædkvalitet (-motilitet, -morfologi, sædvolum)
• Endring i DNA-fragmenteringshastighet (DFI) i sædceller
• Endring i serum Inhibin-B
• Endring i serumnivåer av reproduktive hormoner (FSH, LH, AMH, testosteron, østradiol og SHBG)
• Endring i serumprolaktinnivå
• Endring i fastende glukosenivå
• Endring i fastin insulinnivå
• Endring i c-peptid
• Endring i HbA1c
• Endring i lipidprofil
• Endring i beinmineraltetthet evaluert av DXA.
• Endring i serumnivå av inaktivt vitamin D, 1,25(OH)2D3, 25-OHD3, 24,25(OH)2D3, PTH, alkalisk fosfatase, ionisert kalsium, fosfat, FGF23, Klotho, osteokalcin, matrise gla, osteopontin, kalsitonin, pnp, procollagen III, OPG, RANKL, Sclerostin samt annen benmarkør.
• Endring i valg av assistert reproduktiv assistanseteknikk samt unnfangede graviditeter
• Endring i spontan befruktningshastighet
• Endring i levende fødselsrate
• Endring i antall sædceller som uttrykker RANKL
• Endring i sæd pH, HCO3-, kalsium, sink, fosfat, RANKL, RANK, OPG, FGF23, Klotho, osteocalcin, osteopontin. VDB, 24,25OH2
• Forskjell i infeksjonsrate i de to gruppene

INNSTILLING, VITENSKAPLIG PLAN OG REKRUTTERING

Deltakerne vil inkluderes blant menn henvist til avdeling for vekst og reproduksjon (avd. GR), Rigshospitalet (RH) for utredning av mannlig infertilitet

Dette er en prospektiv, dobbeltblindet, to-arms randomisert kontrollert studie. Intervensjonsgruppe: Hver mann vil få Denosumab 60 mg x 1 sc kun på dag 1 Gruppe som får placebo: Vil følge samme hendelseskjede, selv om Denosumab vil bli erstattet med saltvann

Alle menn vil bli tilbudt samme vitamin D- og kalsiumtilskudd fra og med oppstart av behandlingsstart av Denosumab eller placebo: vitamin D 15 mikrogram og kalsium 400 mg én gang daglig.

DELTAKERE

Det vil bli utført screening av ~500 infertile menn. Etterforskerne antar at ~300 menn vil bli ekskludert og ~100 menn ikke ønsker å delta. Dermed vil 95 menn inkluderes i studien og halvparten vil bli randomisert til aktiv behandling. Etterforskerne forventer et lite frafall (<5) på grunn av høy motivasjon og ingen bivirkninger.

ANALYSE OG INTERVENSJON

Reproduktive hormoner og sæd vil bli analysert på avd. av GR, Rigshospitalet.

ETIKK OG BIVIRKNINGER

Alle pasientene vil ha fullført undersøkelsen før de inviteres til studien. De vil bli informert om potensielle bivirkninger, og de kan forlate rettssaken når som helst uten konsekvenser.

Denosumab er bevist å være trygt i flere randomiserte studier, og er allerede godkjent av både FDA og EMA. Alle bivirkninger vil bli nøye overvåket, registrert og i tilfelle enten uventet frekvens av bivirkninger eller uventede kliniske komplikasjoner vil det bli publisert.

Basert på tidligere fertilitetsstudier ved vår avdeling forventer vi at en stor andel av legevaktpasientene ønsker å delta. Etter vår oppfatning er den skisserte studien etisk forsvarlig, og vi mener at det er nødvendig med randomiserte kliniske studier for å generere fremtidige anbefalinger.

PUBLIKASJON AV RESULTATER

Alle resultater, positive eller negative vil bli sendt til fagfellevurderte vitenskapelige tidsskrifter. Data vil suksessivt innhentes og overføres til en statistisk database.