Säkerhets- och effektivitetsstudie av virusaktiverade mördarimmunceller (VAK) för malign pleural och peritoneal effusion

Det finns ett stort antal immunceller i immuntoleranstillstånd i tumörmikromiljön. Den teoretiska grunden för denna kliniska studie är att använda ultraviolett inaktiverat onkolytiskt herpes simplex-virus typ 2 (UV-oHSV2) för att aktivera PBMC eller immunceller i immuntoleranstillstånd i malign pleura- och peritonealvätska in vitro, och att transfusionera de aktiverade immuncellerna tillbaka. till patientens perifera blod eller pleura- och peritonealvätska för att döda tumörceller i malign pleura- och peritonealvätska för att ytterligare kontrollera volymen av malign pleura- och peritonealvätska.

Vår studie visade att UV-oHSV2 potent aktiverade humana perifera mononukleära blodceller, vilket ledde till ökad antitumöraktivitet in vitro och in vivo. Vi fann också att UV-oHSV2 kunde inducera NK-celler (isolerade från friska donatorers PBMC eller patient pleural effusion) proliferation, utsöndring av IFN-y. Vi fann vidare att UV-oHSV2 kunde förbättra NK-celler (isolerade från friska PBMC eller patientens pleurala effusion) antitumörförmåga in vitro och in vivo.

Baserat på ovanstående forskning genomförde vi en öppen, prospektiv klinisk prövning med ett enda centrum för att utvärdera säkerheten och effektiviteten hos VAK-celler vid behandling av maligna pleurala och peritoneala utgjutningar.

Det detaljerade protokollet enligt följande:

Isolering av lymfocyter från patientens pleurautgjutning eller ascites:

1. Tillsätt pleuravätska i ett 50 ml centrifugrör, centrifugera vid 400 g och kassera supernatanten.
2. Återsuspendera fällningen med 40 ml normal koksaltlösning och passera genom 70 μM U.M och skölj sedan cellfiltret en gång med 5 ml fysiologisk koksaltlösning.
3. Kassera cellfiltret och centrifugera den filtrerade cellsuspensionen i centrifugröret vid 400 g i 5 min. Efter centrifugering, kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 5 ml normal koksaltlösning.
4. Blanda Ficoll upp och ner före användning, ta ett nytt 15ml centrifugrör och tillsätt 5ml Ficoll (sug med spruta).
5. Tillsätt försiktigt 5-6 ml cellsuspension på Ficoll-skiktet.
6. Centrifugera 400g, 30-40min, 18 ℃ - 20 ℃, centrifugen måste långsamt höjas och sänkas, och inställningen för plötslig stoppbroms bör stängas.
7. Ta det mellersta vita membranskiktet (lymfocyter) in i ett nytt centrifugrör.
8. Tillsätt 3 gånger volymen normal saltlösning till de absorberade lymfocyterna, återsuspendera cellerna, centrifugera 400-500 g, 10-15 min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Upprepa tvättningen en gång och den slutliga fällningen återsuspenderas med 5 ml serumfritt medium (RPMI1640).
10. Ta 20 μL cellsuspension i EP-rör, tillsätt lika volym trypanblått färgningslösning, blås försiktigt och räkna med cellräknare.
11. I processen att plantera de isolerade immuncellerna kontrollerades cellodlingsdensiteten inom intervallet 106 och 10 % autolog plasma tillsattes.
12. Ta 4 ml cellsuspension för separat odling och tillsätt motsvarande mängd inaktiverat virus till den återstående cellsuspensionen med infektionsnumret MOI = 1. Beräkningsformeln är följande: volym tillsatt uv-oh2 = (1 × Antal celler tillsatta per brunnsplatta eller flaska / oh2 virustiter)
13. Efter att immuncellerna har planterats placeras de i en 5% CO2-inkubator under 36-48 timmar.

Efter cellodling infunderades 30-50 ml preparerade lymfocyter (kvalificerade genom PCR-sterilitetstest och endotoxintest) i bröstet och bukhålan hos patienten.