Studio sulla sicurezza e l'efficacia delle cellule immunitarie killer attivate da virus (VAK) per il versamento pleurico e peritoneale maligno

Ci sono un gran numero di cellule immunitarie in stato di tolleranza immunitaria nel microambiente tumorale. La base teorica di questo studio clinico consiste nell'utilizzare il virus dell'herpes simplex oncolitico inattivato dall'ultravioletto di tipo 2 (UV-oHSV2) per attivare PBMC o cellule immunitarie in stato di tolleranza immunitaria nel liquido pleurico e peritoneale maligno in vitro e per trasfondere le cellule immunitarie attivate indietro al sangue periferico del paziente o al liquido pleurico e peritoneale per uccidere le cellule tumorali nel liquido pleurico e peritoneale maligno per controllare ulteriormente il volume del liquido pleurico e peritoneale maligno.

Il nostro studio ha indicato che l'UV-oHSV2 ha attivato potentemente le cellule mononucleari del sangue periferico umano portando ad una maggiore attività antitumorale in vitro e in vivo. Abbiamo anche scoperto che UV-oHSV2 potrebbe indurre la proliferazione delle cellule NK (isolate da PBMC di donatori sani o versamento pleurico del paziente), la secrezione di IFN-γ. Abbiamo inoltre scoperto che l'UV-oHSV2 potrebbe migliorare la capacità antitumorale delle cellule NK (isolate da PBMC sane o versamento pleurico del paziente) in vitro e in vivo.

Sulla base della ricerca di cui sopra, abbiamo condotto uno studio clinico prospettico in un unico centro aperto per valutare la sicurezza e l'efficacia delle cellule VAK nel trattamento dei versamenti pleurici e peritoneali maligni.

Il protocollo dettagliato come segue:

Isolamento dei linfociti dai versamenti pleurici o dall'ascite del paziente:

1. Aggiungere il liquido pleurico in una provetta da centrifuga da 50 ml, centrifugare a 400 g e scartare il supernatante.
2. Risospendere il precipitato con 40 ml di soluzione fisiologica normale e passare attraverso 70 μ M U.M, quindi risciacquare il filtro cellulare una volta con 5 ml di soluzione fisiologica.
3. Eliminare il filtro cellulare e centrifugare la sospensione cellulare filtrata nella provetta da centrifuga a 400 g per 5 minuti. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 5 ml di soluzione fisiologica.
4. Mescolare Ficoll capovolto prima dell'uso, prendere una nuova provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 5 ml di Ficoll (aspirare con la siringa).
5. Aggiungere delicatamente 5-6 ml di sospensione cellulare sullo strato Ficoll.
6. Centrifuga 400 g, 30-40 min, 18 ℃ - 20 ℃, la centrifuga deve essere sollevata e abbassata lentamente e l'impostazione della frenata di arresto improvviso deve essere chiusa.
7. Prendere lo strato di membrana bianca centrale (linfociti) in una nuova provetta da centrifuga.
8. Aggiungere 3 volte il volume della soluzione fisiologica normale ai linfociti assorbiti, risospendere le cellule, centrifugare 400-500 g, 10-15 min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Ripetere il lavaggio una volta e il precipitato finale viene risospeso con 5 ml di terreno privo di siero (RPMI1640).
10. Prendere 20 μL di sospensione cellulare nel tubo EP, aggiungere un volume uguale di soluzione colorante tripan blu, soffiare delicatamente e contare con il contatore cellulare.
11. Nel processo di impianto delle cellule immunitarie isolate, la densità della coltura cellulare è stata controllata entro un intervallo di 106 ed è stato aggiunto il 10% di plasma autologo.
12. Prendere 4 ml di sospensione cellulare per coltura separata e aggiungere la quantità corrispondente di virus inattivato alla sospensione cellulare rimanente con il numero di infezione MOI = 1. La formula di calcolo è la seguente: volume di uv-oh2 aggiunto = (1 × numero di cellule aggiunte per piastra o flacone a pozzetti / titolo del virus oh2)
13. Dopo che le cellule immunitarie sono state piantate, vengono poste in un incubatore di CO2 al 5% per 36-48 ore.

Dopo la coltura cellulare, 30-50 ml di linfociti preparati (qualificati mediante test di sterilità PCR e test di endotossine) sono stati infusi nel torace e nella cavità addominale del paziente.