Onderzoek naar veiligheid en werkzaamheid van door virussen geactiveerde killer-immuuncellen (VAK) voor kwaadaardige pleurale en peritoneale effusie

Er zijn een groot aantal immuuncellen in immuuntolerantie in de micro-omgeving van de tumor. De theoretische basis van deze klinische studie is om ultraviolet geïnactiveerd oncolytisch herpes simplex virus type 2 (UV-oHSV2) te gebruiken om PBMC of immuuncellen in immuuntolerantie te activeren in kwaadaardige pleurale en peritoneale vloeistof in vitro, en om de geactiveerde immuuncellen terug te transfusie aan het perifere bloed of pleurale en peritoneale vloeistof van de patiënt om tumorcellen in kwaadaardige pleurale en peritoneale vloeistof te doden om het volume van kwaadaardige pleurale en peritoneale vloeistof verder te beheersen.

Onze studie gaf aan dat UV-oHSV2 krachtig geactiveerde menselijke perifere mononucleaire bloedcellen leidde tot verhoogde antitumoractiviteit in vitro en in vivo. We ontdekten ook dat UV-oHSV2 proliferatie van NK-cellen (geïsoleerd uit PBMC van gezonde donoren of pleurale effusie van patiënten) en uitscheiding van IFN-γ kon induceren. We ontdekten verder dat UV-oHSV2 het antitumorvermogen van NK-cellen (geïsoleerd uit gezonde PBMC of pleurale effusie van de patiënt) in vitro en in vivo zou kunnen versterken.

Op basis van het bovenstaande onderzoek hebben we een open, prospectieve klinische studie in één centrum uitgevoerd om de veiligheid en effectiviteit van VAK-cellen bij de behandeling van kwaadaardige pleurale en peritoneale effusies te evalueren.

Het gedetailleerde protocol als volgt:

Isolatie van lymfocyten uit de pleurale effusies of ascites van de patiënt:

1. Voeg pleurale vloeistof toe aan een centrifugebuis van 50 ml, centrifugeer bij 400 g en gooi het supernatant weg.
2. Resuspendeer het neerslag met 40 ml normale zoutoplossing en passeer door 70 μM UM en spoel het celfilter vervolgens eenmaal met 5 ml fysiologische zoutoplossing.
3. Gooi het celfilter weg en centrifugeer de gefilterde celsuspensie in de centrifugebuis bij 400 g gedurende 5 minuten. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer de celpellet met 5 ml normale zoutoplossing.
4. Ficoll voor gebruik ondersteboven mengen, een nieuwe centrifugebuis van 15 ml nemen en 5 ml Ficoll toevoegen (zuigen met spuit).
5. Voeg voorzichtig 5-6 ml celsuspensie toe aan de Ficoll-laag.
6. Centrifugeer 400 g, 30-40 min, 18 ℃ - 20 ℃, de centrifuge moet langzaam omhoog en omlaag worden gebracht en de instelling voor plotseling stoppen met remmen moet worden gesloten.
7. Neem de middelste witte membraanlaag (lymfocyten) in een nieuwe centrifugebuis.
8. Voeg 3 keer het volume van normale zoutoplossing toe aan de geabsorbeerde lymfocyten, resuspendeer de cellen, centrifugeer 400-500g, 10-15min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Herhaal het wassen eenmaal en het uiteindelijke neerslag wordt opnieuw gesuspendeerd met 5 ml serumvrij medium (RPMI1640).
10. Neem 20 μL celsuspensie in een EP-buis, voeg een gelijk volume van de trypaanblauwe kleuroplossing toe, blaas zachtjes en tel met de celteller.
11. Tijdens het planten van de geïsoleerde immuuncellen werd de dichtheid van de celkweek gecontroleerd binnen het bereik van 106 en werd 10% autoloog plasma toegevoegd.
12. Neem 4 ml celsuspensie voor een aparte kweek en voeg de overeenkomstige hoeveelheid geïnactiveerd virus toe aan de resterende celsuspensie met het infectienummer MOI = 1. De formule voor de berekening is als volgt: volume uv-oh2 toegevoegd = (1 × aantal toegevoegde cellen per putjesplaat of fles / oh2 virustiter)
13. Nadat de immuuncellen zijn geplant, worden ze gedurende 36u-48u in een 5% CO2-incubator geplaatst.

Na celkweek werd 30-50 ml geprepareerde lymfocyten (gekwalificeerd door PCR-steriliteitstest en endotoxinetest) geïnfundeerd in de borst- en buikholte van de patiënt.