Studie bezpečnosti a účinnosti virem aktivovaných zabíječských imunitních buněk (VAK) pro maligní pleurální a peritoneální výpotek

V mikroprostředí nádoru je velké množství imunitních buněk ve stavu imunitní tolerance. Teoretickým základem této klinické studie je použití ultrafialově inaktivovaného onkolytického viru herpes simplex typu 2 (UV-oHSV2) k aktivaci PBMC nebo imunitních buněk ve stavu imunitní tolerance v maligní pleurální a peritoneální tekutině in vitro a ke zpětné transfuzi aktivovaných imunitních buněk do pacientovy periferní krve nebo pleurální a peritoneální tekutiny k usmrcení nádorových buněk v maligní pleurální a peritoneální tekutině k další kontrole objemu maligní pleurální a peritoneální tekutiny.

Naše studie ukázala, že UV-oHSV2 silně aktivoval lidské mononukleární buňky periferní krve, což vedlo ke zvýšené protinádorové aktivitě in vitro a in vivo. Také jsme zjistili, že UV-oHSV2 může indukovat proliferaci NK buněk (izolovaných z PBMC zdravých dárců nebo pleurálního výpotku pacienta), sekreci IFN-γ. Dále jsme zjistili, že UV-oHSV2 může zvýšit protinádorovou schopnost NK buněk (izolovaných ze zdravých PBMC nebo pleurálního výpotku pacienta) in vitro a in vivo.

Na základě výše uvedeného výzkumu jsme provedli otevřenou prospektivní klinickou studii s jedním centrem, která měla vyhodnotit bezpečnost a účinnost buněk VAK při léčbě maligních pleurálních a peritoneálních výpotků.

Podrobný protokol takto:

Izolace lymfocytů z pacientových pleurálních výpotků nebo ascitu:

1. Přidejte pleurální tekutinu do 50ml centrifugační zkumavky, centrifugujte při 400g a odstraňte supernatant.
2. Resuspendujte sraženinu ve 40 ml normálního fyziologického roztoku a nechte projít 70 μM U.M a poté jednou opláchněte buněčný filtr 5 ml fyziologického roztoku.
3. Zlikvidujte buněčný filtr a centrifugujte přefiltrovanou buněčnou suspenzi v centrifugační zkumavce při 400 g po dobu 5 minut. Po odstředění odstraňte supernatant a resuspendujte buněčnou peletu s 5 ml normálního fyziologického roztoku.
4. Před použitím promíchejte Ficoll dnem vzhůru, vezměte novou 15ml centrifugační zkumavku a přidejte 5ml Ficoll (nasajte injekční stříkačkou).
5. Jemně přidejte 5-6 ml buněčné suspenze na vrstvu Ficoll.
6. Centrifugujte 400 g, 30-40 minut, 18 ℃ - 20 ℃, centrifugu je třeba pomalu zvedat a spouštět a nastavení náhlého zastavení brzdění by mělo být uzavřeno.
7. Vezměte střední bílou membránovou vrstvu (lymfocyty) do nové centrifugační zkumavky.
8. Přidejte 3násobek objemu normálního fyziologického roztoku k absorbovaným lymfocytům, resuspendujte buňky, centrifugujte 400-500 g, 10-15 minut, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Opakujte promytí jednou a konečná sraženina se resuspenduje s 5 ml média bez séra (RPMI1640).
10. Vezměte 20 μl buněčné suspenze do EP zkumavky, přidejte stejný objem barvícího roztoku trypanové modři, jemně profoukněte a počítejte počítadlem buněk.
11. V procesu výsadby izolovaných imunitních buněk byla hustota buněčné kultury kontrolována v rozmezí 106 a bylo přidáno 10% autologní plazmy.
12. Odeberte 4 ml buněčné suspenze pro samostatnou kultivaci a přidejte odpovídající množství inaktivovaného viru ke zbývající buněčné suspenzi s číslem infekce MOI = 1. Vzorec pro výpočet je následující: objem přidaného uv-oh2 = (1 × počet buněk přidaných na jamkovou destičku nebo lahvičku / titr viru oh2)
13. Poté, co jsou imunitní buňky zasazeny, jsou umístěny do inkubátoru s 5% CO2 na 36h-48h.

Po kultivaci buněk bylo do hrudníku a břišní dutiny pacienta infundováno 30-50 ml připravených lymfocytů (kvalifikovaných PCR testem sterility a endotoxinovým testem).