Vírus által aktivált gyilkos immunsejtek (VAK) biztonságossági és hatékonysági vizsgálata rosszindulatú pleurális és peritoneális effúzió esetén

A tumor mikrokörnyezetében nagyszámú immuntolerancia állapotban lévő immunsejt található. Ennek a klinikai vizsgálatnak az elméleti alapja a 2-es típusú, ultraibolya inaktivált onkolitikus herpes simplex vírus (UV-oHSV2) alkalmazása a PBMC vagy immuntolerancia állapotú immunsejtek malignus pleurális és peritoneális folyadékban in vitro aktiválására, valamint az aktivált immunsejtek visszatranszfúziójára. a beteg perifériás vérébe vagy pleurális és peritoneális folyadékába, hogy elpusztítsa a daganatos sejteket a rosszindulatú pleurális és peritoneális folyadékban, hogy tovább szabályozza a rosszindulatú pleurális és peritoneális folyadék mennyiségét.

Vizsgálatunk kimutatta, hogy az UV-oHSV2 erősen aktiválta a humán perifériás vér mononukleáris sejtjeit, ami fokozott daganatellenes aktivitást eredményez in vitro és in vivo. Azt is megállapítottuk, hogy az UV-oHSV2 indukálhatja az egészséges donorok PBMC-jéből vagy beteg pleurális folyadékgyüleméből izolált NK-sejtek proliferációját, IFN-γ szekrécióját. Megállapítottuk továbbá, hogy az UV-oHSV2 fokozhatja az egészséges PBMC-ből vagy a beteg pleurális folyadékgyüleméből izolált NK-sejtek tumorellenes képességét in vitro és in vivo.

A fenti kutatások alapján nyílt, egyközpontú, prospektív klinikai vizsgálatot végeztünk a VAK sejtek biztonságosságának és hatékonyságának értékelésére a rosszindulatú pleurális és peritoneális folyadékgyülemek kezelésében.

A részletes protokoll a következő:

Limfociták izolálása a páciens pleurális folyadékgyüleméből vagy asciteséből:

1. Adjon pleurális folyadékot egy 50 ml-es centrifugacsőbe, centrifugálja 400 g-vel, és dobja ki a felülúszót.
2. Szuszpendálja újra a csapadékot 40 ml normál sóoldatban, engedje át 70 μM U.M-en, majd öblítse le egyszer a sejtszűrőt 5 ml fiziológiás sóoldattal.
3. Dobja ki a sejtszűrőt, és centrifugálja a szűrt sejtszuszpenziót a centrifugacsőben 400 g-vel 5 percig. Centrifugálás után dobja ki a felülúszót, és szuszpendálja újra a sejtüledéket 5 ml normál sóoldatban.
4. Használat előtt keverje össze a Ficoll-t fejjel lefelé, vegyen elő egy új 15 ml-es centrifugacsövet, és adjon hozzá 5 ml Ficollt (fecskendővel szívja fel).
5. Óvatosan adjon hozzá 5-6 ml sejtszuszpenziót a Ficoll réteghez.
6. Centrifuga 400 g, 30-40 perc, 18 ℃ - 20 ℃, a centrifugát lassan fel kell emelni és le kell engedni, és a hirtelen leállító fékezést zárni kell.
7. Tegye a középső fehér membránréteget (limfocitákat) egy új centrifugacsőbe.
8. Adjunk a normál sóoldat térfogatának háromszorosát az abszorbeált limfocitákhoz, szuszpendáljuk újra a sejteket, centrifugáljuk 400-500 g, 10-15 perc, 18 ℃ - 20 ℃.
9. A mosást egyszer megismételjük, és a végső csapadékot 5 ml szérummentes tápközegben (RPMI1640) reszuszpendáljuk.
10. Vegyen 20 μl sejtszuszpenziót EP-csőbe, adjon hozzá azonos térfogatú tripánkék festőoldatot, óvatosan fújja le és számolja meg a sejtszámlálóval.
11. Az izolált immunsejtek ültetése során a sejttenyészet sűrűségét 106 tartományban szabályoztuk, és 10% autológ plazmát adtunk hozzá.
12. Vegyünk 4 ml sejtszuszpenziót külön tenyésztéshez, és adjuk hozzá a megfelelő mennyiségű inaktivált vírust a maradék sejtszuszpenzióhoz, amelynek fertőzési száma MOI = 1. A számítási képlet a következő: hozzáadott uv-oh2 térfogata = (1 × hozzáadott sejtek száma lyuklemezenként vagy üvegenként / oh2 vírustiter)
13. Az immunsejtek beültetése után 5%-os CO2 inkubátorba helyezzük őket 36-48 órára.

Sejttenyésztés után 30-50 ml preparált limfocitát (PCR sterilitási teszttel és endotoxin teszttel minősítve) infundáltunk a páciens mellkasába és hasüregébe.