Estudio de seguridad y eficacia de células inmunes asesinas activadas por virus (VAK) para derrame pleural y peritoneal maligno

Hay un gran número de células inmunitarias en estado de inmunotolerancia en el microambiente tumoral. La base teórica de este estudio clínico es utilizar el virus del herpes simple tipo 2 oncolítico inactivado con ultravioleta (UV-oHSV2) para activar PBMC o células inmunitarias en estado de inmunotolerancia en líquido pleural y peritoneal maligno in vitro, y transfundir las células inmunitarias activadas de nuevo. a la sangre periférica del paciente o al líquido pleural y peritoneal para eliminar las células tumorales en el líquido pleural y peritoneal maligno para controlar aún más el volumen del líquido pleural y peritoneal maligno.

Nuestro estudio indicó que UV-oHSV2 activó potentemente las células mononucleares de sangre periférica humana, lo que condujo a una mayor actividad antitumoral in vitro e in vivo. También encontramos que UV-oHSV2 podría inducir la proliferación de células NK (aisladas de PBMC de donantes sanos o derrame pleural del paciente), secreción de IFN-γ. Además, descubrimos que UV-oHSV2 podría mejorar la capacidad antitumoral de las células NK (aisladas de PBMC sanas o derrame pleural del paciente) in vitro e in vivo.

Sobre la base de la investigación anterior, llevamos a cabo un ensayo clínico prospectivo, abierto y de un solo centro para evaluar la seguridad y la eficacia de las células VAK en el tratamiento de derrames pleurales y peritoneales malignos.

El protocolo detallado de la siguiente manera:

Aislamiento de linfocitos de derrames pleurales o ascitis del paciente:

1. Agregue líquido pleural a un tubo de centrífuga de 50 ml, centrifugue a 400 g y deseche el sobrenadante.
2. Resuspender el precipitado con 40 ml de solución salina normal y pasar a través de 70 μ M U.M y luego enjuagar el filtro celular una vez con 5 ml de solución salina fisiológica.
3. Deseche el filtro celular y centrifugue la suspensión celular filtrada en el tubo de centrífuga a 400 g durante 5 min. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular con 5 ml de solución salina normal.
4. Mezcle Ficoll boca abajo antes de usar, tome un tubo de centrífuga nuevo de 15 ml y agregue 5 ml de Ficoll (chupe con jeringa).
5. Agregue suavemente 5-6 ml de suspensión celular en la capa de Ficoll.
6. Centrifugue 400 g, 30-40 min, 18 ℃ - 20 ℃, la centrífuga debe subirse y bajarse lentamente, y la configuración de frenado de parada repentina debe cerrarse.
7. Tome la capa de membrana blanca media (linfocitos) en un nuevo tubo de centrífuga.
8. Agregue 3 veces el volumen de solución salina normal a los linfocitos absorbidos, resuspenda las células, centrifugue 400-500 g, 10-15 min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Repita el lavado una vez y el precipitado final se resuspende con 5 ml de medio sin suero (RPMI1640).
10. Tome 20 μ L de suspensión celular en un tubo EP, agregue un volumen igual de solución de tinción con azul de tripán, sople suavemente y cuente con un contador de células.
11. En el proceso de plantar las células inmunitarias aisladas, la densidad del cultivo celular se controló dentro del rango de 106 y se añadió un 10 % de plasma autólogo.
12. Tome 4 ml de suspensión celular para cultivo separado y agregue la cantidad correspondiente de virus inactivado a la suspensión celular restante con el número de infección MOI = 1. La fórmula de cálculo es la siguiente: volumen de uv-oh2 añadido = (1 × Número de células añadidas por placa de pocillo o botella/título de virus oh2)
13. Después de plantar las células inmunitarias, se colocan en una incubadora con CO2 al 5 % durante 36 a 48 horas.

Después del cultivo celular, se infundieron 30-50 ml de linfocitos preparados (calificados mediante prueba de esterilidad por PCR y prueba de endotoxina) en la cavidad torácica y abdominal del paciente.