Sicherheits- und Wirksamkeitsstudie von virusaktivierten Killerimmunzellen (VAK) für malignen Pleura- und Peritonealerguss

In der Mikroumgebung des Tumors befindet sich eine große Anzahl von Immunzellen im Zustand der Immuntoleranz. Die theoretische Grundlage dieser klinischen Studie ist die Verwendung von UV-inaktiviertem onkolytischem Herpes-simplex-Virus Typ 2 (UV-oHSV2), um PBMC oder Immunzellen im Immuntoleranzzustand in maligner Pleura- und Peritonealflüssigkeit in vitro zu aktivieren und die aktivierten Immunzellen zurückzutransfundieren an das periphere Blut oder die Pleura- und Peritonealflüssigkeit des Patienten, um Tumorzellen in der malignen Pleura- und Peritonealflüssigkeit abzutöten, um das Volumen der malignen Pleura- und Peritonealflüssigkeit weiter zu kontrollieren.

Unsere Studie zeigte, dass UV-oHSV2 menschliche periphere mononukleäre Blutzellen stark aktiviert, was zu einer erhöhten Antitumoraktivität in vitro und in vivo führt. Wir fanden auch heraus, dass UV-oHSV2 die Proliferation von NK-Zellen (isoliert aus PBMC von gesunden Spendern oder Pleuraerguss von Patienten) und die Sekretion von IFN-γ induzieren kann. Wir fanden weiter heraus, dass UV-oHSV2 die Antitumorfähigkeit von NK-Zellen (isoliert aus gesunden PBMC oder Pleuraerguss von Patienten) in vitro und in vivo verbessern könnte.

Basierend auf den oben genannten Forschungsergebnissen haben wir eine offene, prospektive klinische Studie an einem einzigen Zentrum durchgeführt, um die Sicherheit und Wirksamkeit von VAK-Zellen bei der Behandlung von bösartigen Pleura- und Peritonealergüssen zu bewerten.

Das detaillierte Protokoll wie folgt:

Isolierung von Lymphozyten aus Pleuraergüssen oder Aszites des Patienten:

1. Pleuraflüssigkeit in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben, bei 400 g zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
2. Das Präzipitat mit 40 ml normaler Kochsalzlösung resuspendieren und durch 70 μM U.M passieren und dann den Zellfilter einmal mit 5 ml physiologischer Kochsalzlösung spülen.
3. Entsorgen Sie den Zellfilter und zentrifugieren Sie die filtrierte Zellsuspension im Zentrifugenröhrchen bei 400 g für 5 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand verwerfen und das Zellpellet mit 5 ml normaler Kochsalzlösung resuspendieren.
4. Mischen Sie Ficoll vor Gebrauch auf dem Kopf, nehmen Sie ein neues 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 5 ml Ficoll hinzu (mit einer Spritze ansaugen).
5. Geben Sie vorsichtig 5–6 ml Zellsuspension auf die Ficoll-Schicht.
6. Zentrifuge 400 g, 30-40 min, 18 ℃ - 20 ℃, die Zentrifuge muss langsam angehoben und abgesenkt werden, und die Bremseinstellung für plötzlichen Stopp sollte geschlossen sein.
7. Nehmen Sie die mittlere weiße Membranschicht (Lymphozyten) in ein neues Zentrifugenröhrchen.
8. 3-faches Volumen Kochsalzlösung zu den absorbierten Lymphozyten geben, Zellen resuspendieren, zentrifugieren 400-500 g, 10-15 min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Wiederholen Sie das Waschen einmal, und das endgültige Präzipitat wird mit 5 ml serumfreiem Medium (RPMI1640) resuspendiert.
10. Nehmen Sie 20 l Zellsuspension in ein EP-Röhrchen, fügen Sie das gleiche Volumen an Trypanblau-Färbelösung hinzu, blasen Sie vorsichtig und zählen Sie mit dem Zellzähler.
11. Beim Einpflanzen der isolierten Immunzellen wurde die Zellkulturdichte im Bereich von 106 geregelt und 10 % autologes Plasma zugesetzt.
12. Nehmen Sie 4 ml Zellsuspension für eine separate Kultur und fügen Sie die entsprechende Menge an inaktiviertem Virus der verbleibenden Zellsuspension mit der Infektionszahl MOI = 1 hinzu. Die Berechnungsformel lautet wie folgt: Volumen des hinzugefügten uv-oh2 = (1 × Anzahl der hinzugefügten Zellen pro Wellplatte oder Flasche / oh2-Virustiter)
13. Nachdem die Immunzellen eingepflanzt wurden, werden sie für 36 bis 48 Stunden in einen Inkubator mit 5 % CO2 gestellt.

Nach der Zellkultur wurden 30–50 ml vorbereiteter Lymphozyten (qualifiziert durch PCR-Sterilitätstest und Endotoxintest) in die Brust- und Bauchhöhle des Patienten infundiert.