Étude d'innocuité et d'efficacité des cellules immunitaires tueuses activées par un virus (VAK) pour l'épanchement pleural et péritonéal malin

Il existe un grand nombre de cellules immunitaires en état de tolérance immunitaire dans le microenvironnement tumoral. La base théorique de cette étude clinique est d'utiliser le virus de l'herpès simplex oncolytique de type 2 inactivé aux ultraviolets (UV-oHSV2) pour activer les PBMC ou les cellules immunitaires en état de tolérance immunitaire dans le liquide pleural et péritonéal malin in vitro, et de retransfuser les cellules immunitaires activées. au sang périphérique ou au liquide pleural et péritonéal du patient pour tuer les cellules tumorales dans le liquide pleural et péritonéal malin afin de mieux contrôler le volume de liquide pleural et péritonéal malin.

Notre étude a indiqué que les UV-oHSV2 activaient puissamment les cellules mononucléaires du sang périphérique humain, entraînant une activité antitumorale accrue in vitro et in vivo. Nous avons également constaté que les UV-oHSV2 pouvaient induire la prolifération des cellules NK (isolées des PBMC de donneurs sains ou de l'épanchement pleural du patient), la sécrétion d'IFN-γ. Nous avons en outre découvert que l'UV-oHSV2 pouvait améliorer la capacité antitumorale des cellules NK (isolées de PBMC sains ou d'un épanchement pleural du patient) in vitro et in vivo.

Sur la base des recherches ci-dessus, nous avons réalisé un essai clinique prospectif ouvert, monocentrique pour évaluer l'innocuité et l'efficacité des cellules VAK dans le traitement des épanchements pleuraux et péritonéaux malins.

Le protocole détaillé comme suit :

Isolement des lymphocytes des épanchements pleuraux ou des ascites du patient :

1. Ajouter du liquide pleural dans un tube à centrifuger de 50 ml, centrifuger à 400 g et jeter le surnageant.
2. Remettre en suspension le précipité avec 40 ml de solution saline normale et passer à travers 70 μM U.M puis rincer le filtre cellulaire une fois avec 5 ml de sérum physiologique.
3. Jeter le filtre cellulaire et centrifuger la suspension cellulaire filtrée dans le tube à centrifuger à 400 g pendant 5 min. Après centrifugation, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 5 ml de solution saline normale.
4. Mélanger Ficoll à l'envers avant utilisation, prendre un nouveau tube à centrifuger de 15 ml et ajouter 5 ml de Ficoll (aspirer avec une seringue).
5. Ajouter délicatement 5 à 6 ml de suspension cellulaire sur la couche de Ficoll.
6. Centrifugeuse 400g, 30-40min, 18 ℃ - 20 ℃, la centrifugeuse doit être lentement levée et abaissée, et le réglage de freinage d'arrêt soudain doit être fermé.
7. Prenez la couche de membrane blanche moyenne (lymphocytes) dans un nouveau tube à centrifuger.
8. Ajouter 3 fois le volume de solution saline normale aux lymphocytes absorbés, remettre en suspension les cellules, centrifuger 400-500g, 10-15min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Répétez le lavage une fois et le précipité final est remis en suspension avec 5 ml de milieu sans sérum (RPMI1640).
10. Prendre 20 μL de suspension cellulaire dans un tube EP, ajouter un volume égal de solution de coloration au bleu trypan, souffler doucement et compter avec le compteur de cellules.
11. Dans le processus de plantation des cellules immunitaires isolées, la densité de culture cellulaire a été contrôlée dans la plage de 106 et 10 % de plasma autologue ont été ajoutés.
12. Prenez 4 ml de suspension cellulaire pour une culture séparée et ajoutez la quantité correspondante de virus inactivé à la suspension cellulaire restante avec le numéro d'infection MOI = 1. La formule de calcul est la suivante : volume d'uv-oh2 ajouté = (1 × Nombre de cellules ajoutées par plaque à puits ou flacon / titre de virus oh2)
13. Une fois les cellules immunitaires plantées, elles sont placées dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 36h-48h.

Après culture cellulaire, 30 à 50 ml de lymphocytes préparés (qualifiés par le test de stérilité PCR et le test d'endotoxine) ont été perfusés dans la poitrine et la cavité abdominale du patient.