Estudo de segurança e eficácia de células imunes assassinas ativadas por vírus (VAK) para derrame pleural e peritoneal maligno

Há um grande número de células imunes em estado de tolerância imunológica no microambiente tumoral. A base teórica deste estudo clínico é usar o vírus herpes simplex oncolítico inativado por ultravioleta tipo 2 (UV-oHSV2) para ativar PBMC ou células imunológicas em estado de tolerância imunológica em fluido pleural e peritoneal maligno in vitro e transfundir as células imunológicas ativadas de volta ao sangue periférico do paciente ou líquido pleural e peritoneal para matar células tumorais no líquido pleural e peritoneal maligno para controlar ainda mais o volume do líquido pleural e peritoneal maligno.

Nosso estudo indicou que o UV-oHSV2 ativou potentemente as células mononucleares do sangue periférico humano, levando ao aumento da atividade antitumoral in vitro e in vivo. Também descobrimos que o UV-oHSV2 pode induzir a proliferação de células NK (isoladas de PBMC de doadores saudáveis ​​ou derrame pleural do paciente), secreção de IFN-γ. Descobrimos ainda que o UV-oHSV2 pode aumentar a capacidade antitumoral das células NK (isoladas de PBMC saudáveis ​​ou derrame pleural do paciente) in vitro e in vivo.

Com base na pesquisa acima, realizamos um ensaio clínico prospectivo aberto, de centro único, para avaliar a segurança e a eficácia das células VAK no tratamento de derrames pleurais e peritoneais malignos.

O protocolo detalhado da seguinte forma:

Isolamento de linfócitos de derrames pleurais ou ascite do paciente:

1. Adicionar líquido pleural em um tubo de centrífuga de 50ml, centrifugar a 400g e descartar o sobrenadante.
2. Ressuspender o precipitado com 40ml de soro fisiológico e passar por 70 μ M U.M e depois enxaguar o filtro celular uma vez com 5ml de soro fisiológico.
3. Descarte o filtro de células e centrifugue a suspensão de células filtradas no tubo de centrífuga a 400g por 5min. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular com 5ml de solução salina normal.
4. Misture Ficoll de cabeça para baixo antes de usar, pegue um novo tubo de centrífuga de 15ml e adicione 5ml de Ficoll (sugar com seringa).
5. Adicione suavemente 5-6ml de suspensão de células na camada Ficoll.
6. Centrífuga 400g, 30-40min, 18 ℃ - 20 ℃, a centrífuga precisa ser levantada e abaixada lentamente, e a configuração de frenagem de parada repentina deve ser fechada.
7. Pegue a camada de membrana branca intermediária (linfócitos) em um novo tubo de centrífuga.
8. Adicione 3 vezes o volume de solução salina normal aos linfócitos absorvidos, ressuspenda as células, centrifugue 400-500g, 10-15min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Repita a lavagem uma vez e o precipitado final é ressuspenso com 5 ml de meio sem soro (RPMI1640).
10. Pegue 20 μL de suspensão de células no tubo EP, adicione um volume igual de solução de coloração azul de tripano, sopre suavemente e conte com o contador de células.
11. No processo de plantio das células imunes isoladas, a densidade da cultura celular foi controlada dentro da faixa de 106, e 10% de plasma autólogo foi adicionado.
12. Pegue 4ml de suspensão de células para cultura separada e adicione a quantidade correspondente de vírus inativado à suspensão de células restantes com o número de infecção MOI = 1. A fórmula de cálculo é a seguinte: volume de uv-oh2 adicionado = (1 × Número de células adicionadas por placa de poço ou frasco / título de vírus oh2)
13. Depois que as células imunes são plantadas, elas são colocadas em uma incubadora de 5% de CO2 por 36h-48h.

Após a cultura celular, 30-50ML de linfócitos preparados (qualificados por teste de esterilidade por PCR e teste de endotoxina) foram infundidos no tórax e na cavidade abdominal do paciente.