Virusaktivoitujen tappaja-immuunisolujen (VAK) turvallisuus- ja tehokkuustutkimus pahanlaatuista keuhkopussin ja vatsakalvon effuusiota varten

Kasvaimen mikroympäristössä on suuri määrä immuunitoleranssitilassa olevia immuunisoluja. Tämän kliinisen tutkimuksen teoreettisena perustana on käyttää ultraviolettisäteilyllä inaktivoitua onkolyyttistä herpes simplex -virusta tyyppi 2 (UV-oHSV2) PBMC:n tai immuunitoleranssitilassa olevien immuunisolujen aktivoimiseksi pahanlaatuisessa keuhkopussin ja vatsakalvon nesteessä in vitro sekä aktivoituneiden immuunisolujen siirtämiseen takaisin. potilaan perifeeriseen vereen tai keuhkopussin ja vatsakalvon nesteeseen tuumorisolujen tappamiseksi pahanlaatuisessa keuhkopussin ja vatsakalvon nesteessä pahanlaatuisen keuhkopussin ja vatsakalvon nesteen määrän säätelemiseksi edelleen.

Tutkimuksemme osoitti, että UV-oHSV2 aktivoi voimakkaasti ihmisen perifeerisen veren mononukleaarisoluja, mikä lisää kasvaintenvastaista aktiivisuutta in vitro ja in vivo. Havaitsimme myös, että UV-oHSV2 voi indusoida NK-solujen (eristetty terveiden luovuttajien PBMC:stä tai potilaan keuhkopussin effuusiosta) proliferaatiota, IFN-y:n erittymistä. Lisäksi havaitsimme, että UV-oHSV2 voisi parantaa NK-solujen (eristetty terveestä PBMC:stä tai potilaan keuhkopussin effuusiosta) antituumorikykyä in vitro ja in vivo.

Yllä olevan tutkimuksen perusteella suoritimme avoimen, yhden keskuksen, prospektiivisen kliinisen kokeen arvioidaksemme VAK-solujen turvallisuutta ja tehokkuutta pahanlaatuisten keuhkopussin ja peritoneaalien effuusioiden hoidossa.

Yksityiskohtainen protokolla seuraavasti:

Lymfosyyttien eristäminen potilaan pleuraeffuusioista tai askitesista:

1. Lisää keuhkopussin nestettä 50 ml:n sentrifugiputkeen, sentrifugoi 400 g:llä ja hävitä supernatantti.
2. Suspendoi sakka uudelleen 40 ml:aan normaalia suolaliuosta ja vie 70 µM U.M:n läpi ja huuhtele sitten solusuodatin kerran 5 ml:lla fysiologista suolaliuosta.
3. Hävitä solusuodatin ja sentrifugoi suodatettua solususpensiota sentrifugiputkessa 400 g:llä 5 minuutin ajan. Sentrifugoinnin jälkeen hävitä supernatantti ja suspensoi solupelletti uudelleen 5 ml:aan normaalia suolaliuosta.
4. Sekoita Ficoll ylösalaisin ennen käyttöä, ota uusi 15 ml:n sentrifugiputki ja lisää 5 ml Ficollia (ime ruiskulla).
5. Lisää varovasti 5-6 ml solususpensiota Ficoll-kerrokselle.
6. Sentrifugi 400 g, 30-40 min, 18 ℃ - 20 ℃, sentrifugia on nostettava ja laskettava hitaasti ja äkillinen jarrutusasetus on suljettava.
7. Ota keskimmäinen valkoinen kalvokerros (lymfosyytit) uuteen sentrifugiputkeen.
8. Lisää 3 kertaa normaalin suolaliuoksen tilavuus imeytyneisiin lymfosyytteihin, suspensoi solut uudelleen, sentrifugoi 400-500g, 10-15min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Toista pesu kerran, ja lopullinen sakka suspendoidaan uudelleen 5 ml:aan seerumivapaata alustaa (RPMI1640).
10. Ota 20 μl solususpensiota EP-putkeen, lisää yhtä suuri määrä trypaaninsinistä värjäysliuosta, puhalla varovasti ja laske solulaskimella.
11. Eristettyjen immuunisolujen istutusprosessissa soluviljelytiheyttä säädettiin alueella 106 ja lisättiin 10 % autologista plasmaa.
12. Ota 4 ml solususpensiota erillistä viljelmää varten ja lisää vastaava määrä inaktivoitua virusta jäljellä olevaan solususpensioon, jonka infektionumero on MOI = 1. Laskentakaava on seuraava: lisätyn uv-oh2:n tilavuus = (1 × lisättyjen solujen lukumäärä kuoppalevyä tai pulloa kohti / oh2-virustiitteri)
13. Kun immuunisolut on istutettu, ne asetetaan 5 % CO2-inkubaattoriin 36-48 tunniksi.

Soluviljelyn jälkeen 30-50 ml valmistettuja lymfosyyttejä (jota hyväksyttiin PCR-steriilisyystestillä ja endotoksiinitestillä) infusoitiin potilaan rintakehään ja vatsaonteloon.