Badanie bezpieczeństwa i skuteczności aktywowanych wirusem komórek odpornościowych zabójców (VAK) w złośliwym wysięku opłucnowym i otrzewnowym

W mikrośrodowisku guza występuje duża liczba komórek odpornościowych w stanie tolerancji immunologicznej. Teoretyczną podstawą tego badania klinicznego jest wykorzystanie inaktywowanego w ultrafiolecie onkolitycznego wirusa opryszczki pospolitej typu 2 (UV-oHSV2) do aktywacji PBMC lub komórek odpornościowych w stanie tolerancji immunologicznej w złośliwym płynie opłucnowym i otrzewnowym in vitro oraz do transfuzji aktywowanych komórek odpornościowych z powrotem do krwi obwodowej pacjenta lub płynu opłucnowego i otrzewnowego w celu zabicia komórek nowotworowych w złośliwym płynie opłucnowym i otrzewnowym w celu dalszej kontroli objętości złośliwego płynu opłucnowego i otrzewnowego.

Nasze badanie wykazało, że UV-oHSV2 silnie aktywuje ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej, prowadząc do zwiększonej aktywności przeciwnowotworowej in vitro i in vivo. Stwierdziliśmy również, że UV-oHSV2 może indukować proliferację komórek NK (wyizolowanych z PBMC zdrowych dawców lub wysięku opłucnowego pacjenta), wydzielanie IFN-γ. Stwierdziliśmy ponadto, że UV-oHSV2 może wzmacniać zdolność komórek NK (wyizolowanych ze zdrowych PBMC lub wysięku opłucnowego pacjenta) in vitro i in vivo.

Na podstawie powyższych badań przeprowadziliśmy otwarte, jednoośrodkowe, prospektywne badanie kliniczne oceniające bezpieczeństwo i skuteczność komórek VAK w leczeniu złośliwych wysięków opłucnowych i otrzewnowych.

Szczegółowy protokół w następujący sposób:

Izolacja limfocytów z wysięku opłucnowego lub wodobrzusza pacjenta:

1. Dodać płyn opłucnowy do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, odwirować przy 400 g i odrzucić supernatant.
2. Ponownie zawiesić osad w 40 ml soli fizjologicznej i przepuścić przez 70 μM UM, a następnie przepłukać filtr komórkowy jeden raz 5 ml soli fizjologicznej.
3. Wyrzuć filtr komórkowy i odwiruj przefiltrowaną zawiesinę komórek w probówce wirówkowej przy 400 g przez 5 minut. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 5 ml soli fizjologicznej.
4. Przed użyciem wymieszaj Ficoll do góry dnem, weź nową probówkę wirówkową o pojemności 15 ml i dodaj 5 ml Ficoll (ssać strzykawką).
5. Delikatnie dodaj 5-6 ml zawiesiny komórek na warstwę Ficoll.
6. Wirówka 400g, 30-40min, 18 ℃ - 20 ℃, wirówkę należy powoli podnosić i opuszczać, a ustawienie nagłego hamowania powinno być zamknięte.
7. Przenieś środkową białą warstwę błony (limfocyty) do nowej probówki wirówkowej.
8. Do wchłoniętych limfocytów dodać 3-krotność normalnej soli fizjologicznej, ponownie zawiesić komórki, wirować 400-500 g, 10-15 min, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Powtórz płukanie jeden raz, a końcowy osad ponownie zawiesza się w 5 ml pożywki bez surowicy (RPMI1640).
10. Wziąć 20 μl zawiesiny komórek do probówki EP, dodać równą objętość roztworu barwiącego błękitem trypanu, delikatnie przedmuchać i policzyć za pomocą licznika komórek.
11. W procesie wysadzania wyizolowanych komórek odpornościowych kontrolowano gęstość hodowli komórkowej w zakresie 106 i dodawano 10% autologicznego osocza.
12. Weź 4 ml zawiesiny komórek do oddzielnej hodowli i dodaj odpowiednią ilość inaktywowanego wirusa do pozostałej zawiesiny komórek o numerze infekcji MOI = 1. Wzór obliczeniowy jest następujący: objętość dodanego uv-oh2 = (1 × liczba komórek dodanych na studzienkę płytki lub butelkę / miano wirusa oh2)
13. Po zasadzeniu komórek odpornościowych umieszcza się je w inkubatorze z 5% CO2 na 36-48 godzin.

Po hodowli komórkowej 30-50 ML przygotowanych limfocytów (zakwalifikowanych testem sterylności PCR i testem endotoksyn) wstrzyknięto do klatki piersiowej i jamy brzusznej pacjenta.