Исследование безопасности и эффективности активированных вирусом иммунных клеток-киллеров (VAK) при злокачественном плевральном и перитонеальном выпоте

В микроокружении опухоли имеется большое количество иммунных клеток в состоянии иммунотолерантности. Теоретической основой этого клинического исследования является использование ультрафиолетового инактивированного онколитического вируса простого герпеса типа 2 (УФ-оВПГ2) для активации РВМС или иммунных клеток в состоянии иммунной толерантности в злокачественной плевральной и перитонеальной жидкости in vitro, а также переливание активированных иммунных клеток обратно. в периферическую кровь пациента или плевральную и перитонеальную жидкость для уничтожения опухолевых клеток в злокачественной плевральной и перитонеальной жидкости для дальнейшего контроля объема злокачественной плевральной и перитонеальной жидкости.

Наше исследование показало, что УФ-оВПГ2 сильно активирует мононуклеарные клетки периферической крови человека, что приводит к повышению противоопухолевой активности in vitro и in vivo. Мы также обнаружили, что UV-oHSV2 может индуцировать пролиферацию NK-клеток (выделенных из PBMC здоровых доноров или плеврального выпота пациентов), секрецию IFN-γ. Кроме того, мы обнаружили, что УФ-оВПГ2 может усиливать противоопухолевую способность NK-клеток (выделенных из здоровых РВМС или плеврального выпота пациентов) in vitro и in vivo.

На основании вышеуказанного исследования мы провели открытое, одноцентровое, проспективное клиническое исследование для оценки безопасности и эффективности клеток VAK при лечении злокачественных плевральных и перитонеальных выпотов.

Подробный протокол выглядит следующим образом:

Выделение лимфоцитов из плеврального выпота или асцита пациента:

1. Добавьте плевральную жидкость в центрифужную пробирку на 50 мл, отцентрифугируйте при 400 g и выбросьте надосадочную жидкость.
2. Ресуспендируйте осадок с 40 мл физиологического раствора и пропустите через 70 мкМ ЕД, а затем один раз промойте клеточный фильтр 5 мл физиологического раствора.
3. Выбросьте клеточный фильтр и отцентрифугируйте отфильтрованную клеточную суспензию в центрифужной пробирке при 400g в течение 5 минут. После центрифугирования удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок с 5 мл физиологического раствора.
4. Перемешайте фиколл вверх дном перед использованием, возьмите новую центрифужную пробирку на 15 мл и добавьте 5 мл фиколла (всасывайте шприцем).
5. Аккуратно добавьте 5-6 мл клеточной суспензии на слой фиколла.
6. Центрифуга 400 г, 30-40 мин, 18 ℃ - 20 ℃, центрифуга должна медленно подниматься и опускаться, а настройка внезапного торможения должна быть закрыта.
7. Возьмите средний слой белой мембраны (лимфоциты) в новую центрифужную пробирку.
8. Добавить 3-кратный объем физиологического раствора к абсорбированным лимфоцитам, ресуспендировать клетки, центрифугировать 400-500 г, 10-15 мин, 18 ℃ - 20 ℃.
9. Повторяют промывание один раз, и конечный осадок ресуспендируют с 5 мл бессывороточной среды (RPMI1640).
10. Возьмите 20 мкл клеточной суспензии в пробирку EP, добавьте равный объем раствора для окрашивания трипановым синим, аккуратно продуйте и подсчитайте с помощью счетчика клеток.
11. В процессе посева выделенных иммунных клеток плотность культуры клеток контролировали в пределах 106 и добавляли 10% аутологичной плазмы.
12. Возьмите 4 мл клеточной суспензии для отдельной культуры и добавьте соответствующее количество инактивированного вируса к оставшейся клеточной суспензии с числом инфекций MOI = 1. Формула расчета следующая: объем добавленного uv-oh2 = (1 × количество клеток, добавленных на лунку планшета или флакона / титр вируса oh2)
13. После посадки иммунных клеток их помещают в инкубатор с 5% CO2 на 36-48 часов.

После культивирования клеток в грудную и брюшную полость пациента вводили 30-50 мл подготовленных лимфоцитов (квалифицированных по результатам ПЦР-теста на стерильность и эндотоксина).