鼻腔微生物组及其在疾病中的重要性

假设

建议采用以下原假设：

1. 嗅觉功能障碍患者的鼻腔微生物组与嗅觉正常的健康个体没有差异
2. 鼻腔微生物群不会发生季节性波动
3. 鼻粘膜的免疫景观与特定的微生物群无关
4. 鼻内糖皮质激素、dupilumab 和 mepolizumab 均不会影响 CRSwNP 患者的鼻腔微生物组和局部免疫因子 材料和方法 设计：病例对照研究和纵向队列研究。

人群：

1. 60名健康对照：嗅觉正常，无鼻窦疾病、上呼吸道过敏，未鼻内用药
2. 60 名患有嗅觉功能障碍的非 COVID-19 患者
3. 15名急性期COVID-19阳性患者
4. 60名长期患有嗅觉障碍的COVID-19患者持续超过12周
5. 60例CRS患者开始鼻内糖皮质激素治疗
6. 15名CRS患者开始生物治疗

纳入标准

- 18岁以上

排除标准

• 对于活检组，积极抗凝治疗
• 凝血系统疾病
• 近三个月抗生素使用情况
• 近三个月内其他免疫调节药物
• 自身免疫性疾病或免疫缺陷

招募：人群 1、5 和 6 是在丹麦 Gødstrup 地区医院耳鼻喉科接受鼻鼻手术的患者中招募的。 人群 2 和 4 是从丹麦奥胡斯大学临床医学系风味研究所和丹麦 Gødstrup 地区医院风味、平衡和睡眠大学诊所招募的。 第 3 组人群是在奥尔胡斯大学医院和 Gødstrup 地区医院的长期 COVID-19 诊所招募的。 第 1 号人群将包括工作人员和大学生。

临床检查、测量和信息：对于所有参与者，获得有关病史、药物使用、客观耳鼻喉检查（包括上呼吸道内窥镜检查、鼻窦结果测试 22[9]、重度抑郁症）的信息库存[10,11]、迷你精神状态[12]、嗅探棒[13]和口味筛选。

微生物组样本：将收集鼻腔和口腔咽部的拭子，使用针对 16S 和 18S 核糖体 RNA 的新一代测序进行微生物组分析。 通过基于 16S/18S 扩增子的宏基因组学对微生物组进行表征，并通过各种生物信息学工具分析数据，以确定/可视化 α/β 多样性以及主坐标分析 (PCoA)。

鼻内免疫因素：将对鼻活检 (3x3x3 mm) 进行组织学表征，并使用 Vision 10X Genomics 平台上的空间转录组学进行分析。 通过六个拭子收集鼻分泌物并用于表征细胞因子谱。 将采用包含 45 种细胞因子和趋化因子的基于 Luminex 的广泛面板（Invitrogen、细胞因子/趋化因子/生长因子便利 45-Plex Human ProcartaPlex™面板 1），并且样品将一式两份运行。 该组包括已知在 CRS 中发挥作用的细胞因子，并且是生物治疗的目标细胞因子，例如 IL-4、IL-13 和 IL-5。

关于鼻用类固醇使用的数据：开始鼻内糖皮质激素的患者将在治疗开始时纳入其中，并在 24 周后进行随访。

统计数据：如果 alpha 为 5%，幂为 80%，假设不同群体之间细菌的出现率相差 30%，则每组的群体规模应为 42 名参与者。 考虑到 20% 的退出率，研究人员计划将 60 名患者纳入第 1-4 组。 涉及第 5 组和第 6 组的研究是探索性和假设生成性的，尚未进行功效计算。 此外，只有少数患者符合生物治疗的标准；因此，研究人员打算纳入所有在 12-18 个月内开始生物治疗的患者。

可行性：该项目是申请人之间的合作；教授、高级顾问、DMSc、Therese Ovesen、奥尔胡斯大学风味研究所和 Gødstrup 地区医院风味诊所；以及 Statens 血清研究所 (SSI) DMSc 高级顾问 Kurt Fuursted。 风味研究所接收来自丹麦各地的患者，自 2015 年以来，已有近 3000 名患者向该部门咨询，风味诊所和研究所已发表 50 多项有关嗅觉功能障碍的研究报告。 自 2016 年以来，SSI 已开展常规临床微生物组诊断、基于 16S/18S 扩增子的宏基因组学，并且 SSI 将提供该领域的临床和生物信息学专业知识。 该项目进一步利用了与 MOMA 的 CellX 计划的合作，这是一项为单细胞组学提供专业知识和基础设施的国家计划。 总体而言，研究人员保证了所需的患者数量，以及所有测试方法、设备和必要基础设施方面扎实而丰富的经验。

研究 1 和研究 2 的监管要求已经到位，患者入组以及微生物组样本采集已经开始。

伦理：嗅觉或味觉测试、微生物组和免疫因子采样均不会造成危险、不适或疼痛。 所有研究均遵守 GDPR，并且数据按照法律要求存储在计算机上。 该研究履行了赫尔辛基宣言并得到了当地伦理委员会的批准（reg.nr. 1-10-72-213-21）。 关于鼻活检，这是耳鼻喉科门诊的常规检查。 活检在局部麻醉下从中鼻甲取出，尺寸为 3x3x3 毫米。 将向当地伦理委员会发送一份额外的活检许可申请。 由于排除了患有血液系统疾病的患者和接受抗凝治疗的患者，因此出血的风险非常低。

丹麦哥本哈根 Staten 血清研究所细菌、寄生虫和真菌部门将使用鼻腔拭子评估微生物组，并使用针对 16S 和 18S 核糖体 RNA 的下一代测序进行分析。

鼻活检 (3x3x3 mm) 将在 Vision 10X Genomics 平台上使用空间转录组学进行组织学表征和分析。 通过六个拭子收集鼻分泌物并用于表征细胞因子谱。