O microbioma nasal e sua importância nas doenças

Hipóteses

As seguintes hipóteses nulas são sugeridas:

1. O microbioma nasal em pacientes com disfunção olfatória não difere de indivíduos saudáveis ​​com olfato normal
2. Não ocorrem flutuações sazonais no microbioma nasal
3. A paisagem imunológica da mucosa nasal não se correlaciona com microbiomas específicos
4. Nem os glicocorticoides intranasais nem o dupilumabe e o mepolizumabe afetam o microbioma nasal e os fatores imunológicos locais em pacientes com RSCcPN Materiais e métodos Desenho: Estudo de caso-controle e estudo de coorte longitudinal.

Populações:

1. 60 controles saudáveis: olfato normal e ausência de doença nasossinusal, alergias nas vias aéreas superiores e sem medicação intranasal
2. 60 pacientes não-COVID-19 com disfunção olfatória
3. 15 pacientes positivos para COVID-19 na fase aguda
4. 60 pacientes com COVID-19 de longa duração com disfunção olfativa persistindo por mais de 12 semanas
5. 60 pacientes com RSC iniciando glicocorticóides intranasais
6. 15 pacientes com RSC iniciando tratamento biológico

Critério de inclusão

- Maiores de 18 anos

Critério de exclusão

• Para os grupos de biópsia, tratamento com anticoagulação ativa
• Doenças do sistema coagulante
• Antibióticos nos últimos três meses
• Outros medicamentos imunomoduladores nos últimos três meses
• Doença autoimune ou imunodeficiência

Recrutamento: As populações 1, 5 e 6 são recrutadas entre pacientes submetidos à cirurgia nasossinusal no departamento de ouvido-nariz-garganta do Hospital Regional Gødstrup, Dinamarca. As populações 2 e 4 estão inscritas no Flavour Institute, Departamento de Medicina Clínica, Universidade de Aarhus, Dinamarca, e na Clínica Universitária para Sabor, Equilíbrio e Sono, Hospital Regional de Gødstrup, Dinamarca. A população 3 é recrutada nas longas clínicas COVID-19 do Hospital Universitário de Aarhus e do Hospital Regional de Gødstrup. A população 1 será atendida por funcionários e estudantes universitários.

Exames clínicos, medições e informações: Para todos os participantes, são obtidas informações sobre histórico médico, uso de medicamentos, exame objetivo de ouvido, nariz e garganta, incluindo endoscopia das vias aéreas superiores, Teste de Resultado Sino-Nasal-22[9], Depressão Maior Inventário[10,11], Mini Status Mental[12], Sniffin' Sticks[13] e triagem de sabor.

Amostras de microbioma: esfregaços da cavidade nasal e faringe oral serão coletados para análise de microbioma usando sequenciamento de próxima geração visando RNA ribossômico 16S e 18S. A caracterização do microbioma é realizada por metagenômica baseada em amplicon 16S/18S, e os dados são analisados ​​por várias ferramentas de bioinformática para determinação/visualização da diversidade alfa/beta, bem como análise de coordenadas principais (PCoA).

Fatores imunológicos intranasais: Biópsias nasais (3x3x3 mm) serão caracterizadas histologicamente e analisadas usando transcriptômica espacial na plataforma Vision 10X Genomics. A secreção nasal é coletada por meio de seis swabs e utilizada para caracterizar o perfil de citocinas. Um amplo painel baseado em Luminex abrangendo 45 citocinas e quimiocinas será empregado (Invitrogen, Cyto-kine/Chemokine/Growth Factor Convenience 45-Plex Human ProcartaPlex™ Panel 1), e as amostras serão executadas em duplicata. O painel inclui citocinas conhecidas por desempenharem um papel na SRC e que são alvo de tratamento biológico, como IL-4, IL-13 e IL-5.

Dados sobre o uso de esteróides nasais: Os pacientes que iniciarem glicocorticóides intranasais serão incluídos no início do tratamento e o acompanhamento será após 24 semanas.

Estatísticas: Com um alfa de 5% e um poder de 80%, o tamanho da população para cada grupo deve ser de 42 participantes, assumindo que a ocorrência de bactérias difere em 30% entre as populações. Levando em consideração 20% de abandono, os investigadores pretendem incluir 60 pacientes no grupo 1-4. Os estudos envolvendo os grupos 5 e 6 são exploratórios e geradores de hipóteses, e não foram realizados cálculos de poder. Além disso, apenas alguns pacientes preenchem os critérios para tratamento biológico; portanto, os investigadores pretendem incluir todos os pacientes que iniciam o tratamento biológico dentro de 12-18 meses.

Viabilidade: O projeto é uma colaboração entre o candidato; professor, consultor sênior, DMSc, Therese Ovesen, Flavor Institute, Aarhus University & The Flavor Clinic, Gødstrup Regional Hospital; e consultor sênior, DMSc, Kurt Fuursted, Statens Serum Institute (SSI). O Flavor Institute recebe pacientes de toda a Dinamarca e, desde 2015, quase 3.000 pacientes consultaram a unidade, e mais de 50 estudos de pesquisa sobre disfunção olfativa foram publicados pela Flavor Clinic and Institute. Desde 2016, o diagnóstico clínico de rotina do microbioma, metagenômica baseada em amplicon 16S/18S, tem sido conduzido na SSI, e a experiência clínica e de bioinformática será fornecida neste campo pela SSI. O projeto aproveita ainda uma colaboração com a iniciativa CellX sediada no MOMA, que é uma iniciativa nacional que fornece conhecimento e infraestrutura para ômicas de célula única. No geral, os investigadores garantem o número necessário de pacientes e uma experiência sólida e extensa com todos os métodos de teste, equipamentos e a infraestrutura necessária.

Os requisitos regulamentares para os Estudos 1 e 2 estão em vigor e o recrutamento de pacientes, bem como a recolha de amostras de microbioma, já começou.

Ética: Nenhum dos testes de olfato ou paladar, nem amostragem de microbioma e fatores imunológicos causam perigo, desconforto ou dor. O GDPR é cumprido em todos os estudos e os dados são armazenados em computadores seguindo os requisitos legais. O estudo cumpre a declaração de Helsinque e é aprovado pelo comitê de ética local (reg.nr. 1-10-72-213-21). Em relação às biópsias nasais, este é um trabalho rotineiro nos ambulatórios de otorrinolaringologia. A biópsia é retirada da concha média sob anestesia local e mede 3x3x3 mm. Um pedido adicional de permissão para obtenção de biópsias será enviado ao comitê de ética local. O risco de sangramento é muito baixo, pois são excluídos pacientes com doenças hematológicas e pacientes em terapia anticoagulante.

O microbioma será avaliado usando swabs da cavidade nasal e analisado usando sequenciamento de próxima geração visando RNA ribossômico 16S e 18S no Departamento de Bactérias, Parasitas e Fungos do Staten Serum Institute, Copenhague, Dinamarca.

Biópsias nasais (3x3x3 mm) serão caracterizadas histologicamente e analisadas por meio de transcriptômica espacial na plataforma Vision 10X Genomics. A secreção nasal é coletada por meio de seis swabs e utilizada para caracterizar o perfil de citocinas.