Nasala mikrobiomet och dess betydelse vid sjukdom

Hypoteser

Följande nollhypoteser föreslås:

1. Det nasala mikrobiomet hos patienter med olfaktorisk dysfunktion skiljer sig inte från friska individer med normal lukt
2. Säsongsvariationer i näsmikrobiomet förekommer inte
3. Det immunologiska landskapet i nässlemhinnan korrelerar inte med specifika mikrobiomer
4. Varken intranasala glukokortikoider eller dupilumab och mepolizumab påverkar det nasala mikrobiomet och lokala immunfaktorer hos patienter med CRSwNP Material och metoder Design: Fallkontrollstudie och longitudinell kohortstudie.

Populationer:

1. 60 friska kontroller: Normalt luktsinne och frånvaro av sino-nasal sjukdom, övre luftvägsallergier och ingen intranasal medicin
2. 60 icke-COVID-19-patienter med luktdysfunktion
3. 15 covid-19 positiva patienter i den akuta fasen
4. 60 långa covid-19-patienter med luktdysfunktion som kvarstår i mer än 12 veckor
5. 60 patienter med CRS som initierar intranasala glukokortikoider
6. 15 patienter med CRS som påbörjar biologisk behandling

Inklusionskriterier

- Äldre än 18 år

Exklusions kriterier

• För biopsigrupperna, aktiv antikoagulationsbehandling
• Sjukdomar i koagulantsystemet
• Antibiotika under de senaste tre månaderna
• Andra immunmodulerande läkemedel under de senaste tre månaderna
• Autoimmun sjukdom eller immunbrist

Rekrytering: Population 1, 5 och 6 rekryteras bland patienter som genomgår sino-nasal kirurgi vid öron-näsa-halsavdelningen, Regionsjukhuset Gødstrup, Danmark. Populationerna 2 och 4 är inskrivna från Flavour Institute, Institutionen för klinisk medicin, Aarhus Universitet, Danmark, och University Clinic for Flavour, Balance and Sleep, Gødstrup Regional Hospital, Danmark. Befolkning 3 rekryteras till de långa covid-19-klinikerna på Aarhus Universitetssjukhus och på Gødstrup Regionssjukhus. Population 1 kommer att förses med personal och universitetsstudenter.

Kliniska undersökningar, mätningar och information: För alla deltagare erhålls information om sjukdomshistoria, medicinanvändning, objektiv öron-, näs- och halsundersökning inklusive endoskopi av övre luftvägar, Sino-Nasal Outcome Test-22[9], Major Depression Inventering[10,11], Mini Mental Status[12], Sniffin' Sticks[13] och smakkontroll.

Mikrobiomprover: Svabbar från näshålan och munsvalget kommer att samlas in för mikrobiomanalys med hjälp av nästa generations sekvensering riktad mot 16S och 18S ribosomalt RNA. Karakterisering av mikrobiomet utförs av 16S/18S amplikonbaserad metagenomik, och data analyseras med olika bioinformatiska verktyg för bestämning/visualisering av alfa/beta-diversitet samt principal koordinatanalys (PCoA).

Intranasala immunfaktorer: Nasala biopsier (3x3x3 mm) kommer att karakteriseras histologiskt och analyseras med hjälp av spatial transcriptomics på Vision 10X Genomics-plattformen. Nasal sekret samlas upp med hjälp av sex pinnar och används för att karakterisera cytokinprofilen. En bred Luminex-baserad panel som omfattar 45 cytokiner och kemokiner kommer att användas (Invitrogen, Cyto-kine/Chemokine/Growth Factor Convenience 45-Plex Human ProcartaPlex™ Panel 1), och proverna kommer att köras i duplikat. Panelen inkluderar cytokiner som är kända för att spela en roll i CRS, och som är inriktade på biologisk behandling, såsom IL-4, IL-13 och IL-5.

Data om nasal steroidanvändning: Patienter som börjar med intranasala glukokortikoider kommer att inkluderas vid påbörjad behandling och uppföljning kommer att ske efter 24 veckor.

Statistik: Med en alfa på 5 % och en styrka på 80 % bör populationsstorleken för varje grupp vara 42 deltagare, förutsatt att förekomsten av bakterier skiljer sig med 30 % mellan populationerna. Med hänsyn till 20 % avhopp, siktar utredarna på att inkludera 60 patienter i grupp 1-4. Studierna som involverar grupp 5 och 6 är utforskande och hypotesgenererande och effektberäkningar har inte utförts. Vidare är det bara ett fåtal patienter som uppfyller kriterierna för biologisk behandling; därför avser utredarna att inkludera alla patienter som påbörjar biologisk behandling inom 12-18 månader.

Genomförbarhet: Projektet är ett samarbete mellan den sökande; professor, senior konsult, DMSc, Therese Ovesen, Flavor Institute, Aarhus Universitet & The Flavour Clinic, Gødstrup Regionsjukhus; och senior konsult, DMSc, Kurt Fuursted, Statens Serum Institute (SSI). Flavor Institute, tar emot patienter från hela Danmark, och sedan 2015 har nästan 3000 patienter konsulterat enheten, och mer än 50 forskningsstudier av luktdysfunktion har publicerats från Flavour Clinic and Institute. Sedan 2016 har rutinmässig klinisk mikrobiomdiagnostik, 16S/18S amplikonbaserad metagenomik, bedrivits vid SSI, och både klinisk och bioinformatisk expertis kommer att tillhandahållas inom detta område av SSI. Projektet utnyttjar ytterligare ett samarbete med CellX-initiativet inrymt på MOMA, vilket är ett nationellt initiativ som tillhandahåller expertis och infrastruktur för encellsteknik. Sammantaget garanterar utredarna både erforderligt antal patienter och en gedigen och lång erfarenhet av alla testmetoder, utrustning och nödvändig infrastruktur.

De regulatoriska kraven för Studie 1 och 2 är på plats och patientregistrering samt insamling av mikrobiomprover har redan börjat.

Etik: Inget av lukt- eller smaktesterna, inte heller provtagning av mikrobiom och immunfaktorer orsakar fara, obehag eller smärta. GDPR efterlevs i alla studier och data lagras på datorer enligt lagkrav. Studien uppfyller Helsingforsdeklarationen och är godkänd av den lokala etiska kommittén (reg.nr. 1-10-72-213-21). När det gäller näsbiopsier är detta rutinarbete på ÖNH-polikliniker. Biopsien tas från mittturbinatet i lokalbedövning och mäter 3x3x3 mm. Ytterligare en ansökan om tillstånd att få biopsierna kommer att skickas till den lokala etiska kommittén. Risken för blödning är mycket låg då patienter med hematologiska sjukdomar och patienter i antikoagulantia är uteslutna.

Mikrobiomet kommer att utvärderas med hjälp av pinnprover från näshålan och analyseras med hjälp av nästa generations sekvensering riktad mot 16S och 18S ribosomalt RNA vid Institutionen för bakterier, parasiter och svampar vid Staten Serum Institute, Köpenhamn, Danmark.

Nasala biopsier (3x3x3 mm) kommer att karakteriseras histologiskt och analyseras med hjälp av rumslig transkriptomi på Vision 10X Genomics-plattformen. Nasal sekret samlas upp med hjälp av sex pinnar och används för att karakterisera cytokinprofilen.