Nenän mikrobiomi ja sen merkitys sairauksissa

Hypoteesit

Seuraavat nollahypoteesit ehdotetaan:

1. Nenän mikrobiomi potilailla, joilla on hajuaistihäiriö, ei eroa terveistä yksilöistä, joilla on normaali haju
2. Kausivaihteluita nenän mikrobiomissa ei esiinny
3. Nenän limakalvon immunologinen maisema ei korreloi tiettyjen mikrobiomien kanssa
4. Sen paremmin intranasaaliset glukokortikoidit kuin dupilumabi ja mepolitsumabi eivät vaikuta nenän mikrobioomiin ja paikallisiin immuunitekijöihin potilailla, joilla on CRSwNP Materiaalit ja menetelmät Suunnittelu: Tapauskontrollitutkimus ja pitkittäinen kohorttitutkimus.

Populaatiot:

1. 60 tervettä kontrollia: Normaali hajuaisti ja sino-nenäsairauden puuttuminen, yläilmatieallergiat ja ei intranasaalista lääkitystä
2. 60 ei-COVID-19-potilasta, joilla on hajuhäiriöitä
3. 15 COVID-19-positiivista potilasta akuutissa vaiheessa
4. 60 pitkää COVID-19-potilasta, joilla hajuhäiriöt jatkuvat yli 12 viikkoa
5. 60 CRS-potilasta aloittivat intranasaalisen glukokortikoidihoidon
6. 15 CRS-potilasta aloitti biologisen hoidon

Sisällyttämiskriteerit

- Yli 18-vuotias

Poissulkemiskriteerit

• Biopsiaryhmille aktiivinen antikoagulaatiohoito
• Hyytymisjärjestelmän sairaudet
• Antibiootit viimeisen kolmen kuukauden aikana
• Muut immunomoduloivat lääkkeet viimeisen kolmen kuukauden aikana
• Autoimmuunisairaus tai immuunipuutos

Rekrytointi: Populaatiot 1, 5 ja 6 rekrytoidaan potilaiden joukossa, joille tehdään sino-nenäleikkaus Gødstrupin aluesairaalan korva-nenä-kurkkuosastolla, Tanska. Populaatiot 2 ja 4 ovat ilmoittautuneet Flavor Institute, Kliinisen lääketieteen laitokselta, Århusin yliopisto, Tanska, ja University Clinic for Flavour, Balance ja Sleep, Gødstrupin aluesairaala, Tanska. Väestö 3 rekrytoidaan pitkiin COVID-19-klinikoihin Aarhusin yliopistolliseen sairaalaan ja Gødstrupin aluesairaalaan. Väestö 1 toimitetaan henkilökunnalla ja yliopisto-opiskelijoilla.

Kliiniset tutkimukset, mittaukset ja tiedot: Kaikki osallistujat saavat tietoa sairaushistoriasta, lääkkeiden käytöstä, objektiivisesta korvan, nenän ja kurkun tutkimuksesta, mukaan lukien ylempien hengitysteiden endoskopia, Sino-nasal Outcome Test-22[9], vakava masennus Inventory[10,11], Mini Mental Status[12], Sniffin' Sticks[13] ja makuseulonta.

Mikrobiominäytteet: Vanupuikkoja nenäontelosta ja suun nielusta kerätään mikrobiomianalyysiä varten käyttämällä seuraavan sukupolven sekvensointia, joka kohdistuu 16S- ja 18S-ribosomaaliseen RNA:han. Mikrobiomin karakterisointi suoritetaan 16S/18S-amplikonipohjaisella metagenomiikalla, ja tiedot analysoidaan erilaisilla bioinformaattisilla työkaluilla alfa/beta-monimuotoisuuden määrittämiseksi/visualisoimiseksi sekä pääkoordinaattianalyysillä (PCoA).

Nenänsisäiset immuunitekijät: Nenäbiopsiat (3x3x3 mm) karakterisoidaan histologisesti ja analysoidaan spatiaalisen transkriptomiikan avulla Vision 10X Genomics -alustalla. Nenän erite kerätään kuudella vanupuikolla ja käytetään sytokiiniprofiilin karakterisointiin. Käytetään laajaa Luminex-pohjaista paneelia, joka sisältää 45 sytokiinia ja kemokiinia (Invitrogen, Cyto-kine/Chemokine/Growth Factor Convenience 45-Plex Human ProcartaPlex™ Panel 1), ja näytteet ajetaan kahtena rinnakkaisena. Paneeli sisältää sytokiineja, joilla tiedetään olevan rooli CRS:ssä ja jotka ovat biologisen hoidon kohteena, kuten IL-4, IL-13 ja IL-5.

Tiedot nenän steroidien käytöstä: Potilaat, jotka aloittavat intranasaalisen glukokortikoidin käytön, otetaan mukaan hoidon alkaessa ja seuranta suoritetaan 24 viikon kuluttua.

Tilastot: Kun alfa on 5 % ja teho 80 %, kunkin ryhmän populaation koon tulisi olla 42 osallistujaa, olettaen, että bakteerien esiintyvyys vaihtelee populaatioiden välillä 30 %. Kun otetaan huomioon 20 % keskeyttäminen, tutkijoiden tavoitteena on sisällyttää 60 potilasta ryhmään 1-4. Ryhmän 5 ja 6 tutkimukset ovat tutkivia ja hypoteeseja luovia, eikä teholaskelmia ole tehty. Lisäksi vain harvat potilaat täyttävät biologisen hoidon kriteerit; Siksi tutkijat aikovat ottaa mukaan kaikki potilaat, jotka aloittavat biologisen hoidon 12-18 kuukauden sisällä.

Toteutettavuus: Hanke on hakijan välinen yhteistyö; professori, vanhempi konsultti, DMSc, Therese Ovesen, Flavor Institute, Aarhusin yliopisto & The Flavor Clinic, Gødstrupin aluesairaala; ja vanhempi konsultti, DMSc, Kurt Fuursted, Statens Serum Institute (SSI). Flavor Institute vastaanottaa potilaita kaikkialta Tanskasta, ja vuodesta 2015 lähtien yksikössä on käynyt lähes 3000 potilasta, ja Flavor Clinic and Institutesta on julkaistu yli 50 tutkimusta hajuhäiriöistä. Vuodesta 2016 lähtien SSI:ssä on suoritettu rutiininomaista kliinistä mikrobiomidiagnostiikkaa, 16S/18S-amplikonipohjaista metagenomiikkaa, ja SSI tarjoaa tällä alalla sekä kliinistä että bioinformaattista asiantuntemusta. Hankkeessa hyödynnetään edelleen yhteistyötä MOMAssa sijaitsevan CellX-aloitteen kanssa, joka on kansallinen aloite, joka tarjoaa asiantuntemusta ja infrastruktuuria yksisoluiseen omikkiin. Kaiken kaikkiaan tutkijat takaavat sekä tarvittavan potilasmäärän että vankan ja laajan kokemuksen kaikista testimenetelmistä, laitteista ja tarvittavasta infrastruktuurista.

Tutkimusten 1 ja 2 sääntelyvaatimukset ovat voimassa ja potilaiden ilmoittautuminen sekä mikrobiominäytteiden kerääminen on jo aloitettu.

Etiikka: Mikään haju- tai makutesteistä tai mikrobiomista ja immuunitekijöistä näytteenotto ei aiheuta vaaraa, epämukavuutta tai kipua. GDPR:ää noudatetaan kaikissa tutkimuksissa ja tiedot tallennetaan tietokoneille lakisääteisten vaatimusten mukaisesti. Tutkimus täyttää Helsingin julistuksen ja on paikallisen eettisen toimikunnan (reg.nr.) hyväksymä. 1-10-72-213-21). Mitä tulee nenän biopsioihin, tämä on rutiinityötä ENT-poliklinikoissa. Biopsia otetaan keskiturbinaatista paikallispuudutuksessa ja sen mitat ovat 3x3x3 mm. Paikalliselle eettiselle toimikunnalle lähetetään lisähakemus biopsioiden ottamiseen. Verenvuotoriski on erittäin pieni, koska hematologisia sairauksia sairastavat potilaat ja potilaat, jotka saavat antikoagulanttihoitoa, ovat poissuljettuja.

Mikrobiomi arvioidaan käyttämällä nenäontelosta otettuja vanupuikkoja ja analysoidaan seuraavan sukupolven sekvensoinnilla, joka kohdistuu 16S- ja 18S-ribosomaaliseen RNA:han Staten Serum Institutessa, Kööpenhaminassa, Tanskan bakteerien, loisten ja sienten osastolla.

Nenäbiopsiat (3x3x3 mm) karakterisoidaan histologisesti ja analysoidaan spatiaalista transkriptomiikkaa käyttäen Vision 10X Genomics -alustalla. Nenän erite kerätään kuudella vanupuikolla ja käytetään sytokiiniprofiilin karakterisointiin.