Nesemikrobiomet og dets betydning for sykdom

Hypoteser

Følgende nullhypoteser er foreslått:

1. Det nasale mikrobiomet hos pasienter med luktdysfunksjon skiller seg ikke fra friske individer med normal lukt
2. Sesongmessige svingninger i nesemikrobiomet forekommer ikke
3. Det immunologiske landskapet til neseslimhinnen korrelerer ikke med spesifikke mikrobiomer
4. Verken intranasale glukokortikoider eller dupilumab og mepolizumab påvirker det nasale mikrobiomet og lokale immunfaktorer hos pasienter med CRSwNP Materialer og metoder Design: Kasuskontrollstudie og longitudinell kohortstudie.

Populasjoner:

1. 60 sunne kontroller: Normal luktesans og fravær av sino-nasal sykdom, øvre luftveisallergi og ingen intranasal medisinering
2. 60 ikke-COVID-19 pasienter med luktdysfunksjon
3. 15 COVID-19 positive pasienter i akuttfasen
4. 60 lange COVID-19-pasienter med luktdysfunksjon som vedvarer i mer enn 12 uker
5. 60 pasienter med CRS som starter intranasale glukokortikoider
6. 15 pasienter med CRS som starter biologisk behandling

Inklusjonskriterier

- Eldre enn 18 år

Eksklusjonskriterier

• For biopsigruppene aktiv antikoagulasjonsbehandling
• Sykdommer i koagulasjonssystemet
• Antibiotika de siste tre månedene
• Andre immunmodulerende legemidler de siste tre månedene
• Autoimmun sykdom eller immunsvikt

Rekruttering: Populasjon 1, 5 og 6 rekrutteres blant pasienter som gjennomgår sino-nasal kirurgi ved øre-nese-halsavdelingen, Regionshospitalet Gødstrup, Danmark. Populasjon 2 og 4 er registrert fra Flavour Institute, Institutt for klinisk medisin, Aarhus Universitet, Danmark, og Universitetsklinikken for Flavour, Balance, and Sleep, Gødstrup Regional Hospital, Danmark. Befolkning 3 er rekruttert ved de lange COVID-19-klinikkene ved Aarhus Universitetssykehus og ved Gødstrup Regionssykehus. Befolkning 1 vil bli forsynt med ansatte og universitetsstudenter.

Kliniske undersøkelser, målinger og informasjon: For alle deltakere innhentes informasjon om sykehistorie, medisinbruk, objektiv øre-, nese- og halsundersøkelse inkludert endoskopi av øvre luftveier, Sino-Nasal Outcome Test-22[9], Major Depression Inventar[10,11], Mini Mental Status[12], Sniffin' Sticks[13] og smakskontroll.

Mikrobiomprøver: Vatter fra nesehulen og munnsvelget vil bli samlet inn for mikrobiomanalyse ved bruk av neste generasjons sekvensering rettet mot 16S og 18S ribosomalt RNA. Karakterisering av mikrobiomet utføres av 16S/18S amplikonbasert metagenomikk, og data analyseres med ulike bioinformatiske verktøy for bestemmelse/visualisering av alfa/beta-diversitet samt prinsipiell koordinatanalyse (PCoA).

Intranasale immunfaktorer: Nasale biopsier (3x3x3 mm) vil bli karakterisert histologisk og analysert ved bruk av romlig transkriptomikk på Vision 10X Genomics-plattformen. Nesesekresjon samles opp ved hjelp av seks vattpinner og brukes til å karakterisere cytokinprofilen. Et bredt Luminex-basert panel som omfatter 45 cytokiner og kjemokiner vil bli brukt (Invitrogen, Cyto-kine/Chemokine/Growth Factor Convenience 45-Plex Human ProcartaPlex™ Panel 1), og prøver vil bli kjørt i duplikat. Panelet inkluderer cytokiner som er kjent for å spille en rolle i CRS, og som er målrettet av biologisk behandling, slik som IL-4, IL-13 og IL-5.

Data om nasal steroidbruk: Pasienter som starter intranasale glukokortikoider vil inkluderes ved oppstart av behandling og oppfølging vil være etter 24 uker.

Statistikk: Med en alfa på 5 % og en potens på 80 %, bør populasjonsstørrelsen for hver gruppe være 42 deltakere, forutsatt at forekomsten av bakterier er forskjellig med 30 % mellom populasjonene. Med 20 % frafall i betraktning, tar etterforskerne sikte på å inkludere 60 pasienter i gruppe 1-4. Studiene som involverer gruppe 5 og 6 er utforskende og hypotesegenererende, og effektberegninger er ikke utført. Videre er det kun få pasienter som oppfyller kriteriene for biologisk behandling; derfor har etterforskerne til hensikt å inkludere alle pasienter som starter biologisk behandling innen 12-18 måneder.

Gjennomførbarhet: Prosjektet er et samarbeid mellom søker; professor, seniorkonsulent, DMSc, Therese Ovesen, Flavor Institute, Aarhus Universitet & The Flavour Clinic, Gødstrup Regionssykehus; og seniorkonsulent, DMSc, Kurt Fuursted, Statens Serum Institutt (SSI). Flavour Institute, tar imot pasienter fra hele Danmark, og siden 2015 har nesten 3000 pasienter konsultert enheten, og mer enn 50 forskningsstudier av luktdysfunksjon er publisert fra Flavour Clinic and Institute. Siden 2016 har rutinemessig klinisk mikrobiomdiagnostikk, 16S/18S amplikonbasert metagenomikk, blitt utført ved SSI, og både klinisk og bioinformatisk ekspertise vil bli gitt på dette feltet av SSI. Prosjektet utnytter videre et samarbeid med CellX-initiativet som ligger på MOMA, som er et nasjonalt initiativ som gir ekspertise og infrastruktur for encellet omics. Samlet sett står etterforskerne inne for både nødvendig antall pasienter, og solid og lang erfaring med alle testmetoder, utstyr og nødvendig infrastruktur.

De regulatoriske kravene for studie 1 og 2 er på plass og pasientregistrering samt innsamling av mikrobiomprøver har allerede begynt.

Etikk: Ingen av lukt- eller smakstestene, og heller ikke prøvetaking av mikrobiom og immunfaktorer forårsaker fare, ubehag eller smerte. GDPR overholdes i alle studier og data lagres på datamaskiner etter lovkrav. Studien oppfyller Helsinki-erklæringen og er godkjent av den lokale etiske komiteen (reg.nr. 1-10-72-213-21). Når det gjelder nesebiopsier er dette rutinearbeid i ØNH-poliklinikker. Biopsien tas fra mellomturbinat i lokalbedøvelse og måler 3x3x3 mm. En tilleggssøknad om tillatelse til å få biopsiene sendes til den lokale etiske komité. Risikoen for blødning er svært lav da pasienter med hematologiske sykdommer og pasienter i antikoagulasjonsbehandling er ekskludert.

Mikrobiomet vil bli evaluert ved bruk av vattpinner fra nesehulen og analysert ved bruk av neste generasjons sekvensering rettet mot 16S og 18S ribosomalt RNA ved Institutt for bakterier, parasitter og sopp ved Staten Serum Institute, København, Danmark.

Nesebiopsier (3x3x3 mm) vil bli karakterisert histologisk og analysert ved bruk av romlig transkriptomikk på Vision 10X Genomics-plattformen. Nesesekresjon samles opp ved hjelp av seks vattpinner og brukes til å karakterisere cytokinprofilen.