Nosní mikrobiom a jeho význam v nemoci

Hypotézy

Navrhují se následující nulové hypotézy:

1. Nosní mikrobiom u pacientů s čichovou dysfunkcí se neliší od zdravých jedinců s normálním čichem
2. K sezónním výkyvům v nosním mikrobiomu nedochází
3. Imunologická krajina nosní sliznice nekoreluje se specifickými mikrobiomy
4. Ani intranazální glukokortikoidy, ani dupilumab a mepolizumab neovlivňují nosní mikrobiom a lokální imunitní faktory u pacientů s CRSwNP Materiály a metody Design: Případově-kontrolní studie a longitudinální kohortová studie.

Populace:

1. 60 zdravých kontrol: Normální čich a absence sinonosního onemocnění, alergie horních cest dýchacích a žádná intranazální medikace
2. 60 pacientů mimo COVID-19 s čichovou dysfunkcí
3. 15 pacientů pozitivních na COVID-19 v akutní fázi
4. 60 dlouhodobých pacientů s COVID-19 s čichovou dysfunkcí přetrvávající déle než 12 týdnů
5. 60 pacientů s CRS zahajující intranazální glukokortikoidy
6. 15 pacientů s CRS zahajuje biologickou léčbu

Kritéria pro zařazení

- Starší 18 let

Kritéria vyloučení

• U bioptických skupin aktivní antikoagulační léčba
• Nemoci koagulačního systému
• Antibiotika v posledních třech měsících
• Další imunomodulační léky v posledních třech měsících
• Autoimunitní onemocnění nebo imunodeficience

Nábor: Populace 1, 5 a 6 se rekrutuje mezi pacienty podstupujícími sinonosní operaci na ušním, noso-krčním oddělení, Regional Hospital Gødstrup, Dánsko. Populace 2 a 4 jsou zapsány z Flavour Institute, Department of Clinical Medicine, Aarhus University, Dánsko, a University Clinic for Flavour, Balance, and Sleep, Gødstrup Regional Hospital, Dánsko. Populace 3 se rekrutuje na dlouhých klinikách COVID-19 ve fakultní nemocnici Aarhus a v regionální nemocnici Gødstrup. Populace 1 bude zásobována zaměstnanci a studenty vysokých škol.

Klinická vyšetření, měření a informace: Pro všechny účastníky jsou získány informace o anamnéze, užívání léků, objektivním vyšetření ucha, nosu a krku včetně endoskopie horních cest dýchacích, Sino-nasal Outcome Test-22[9], Velké deprese Inventory[10,11], Mini Mental Status[12], Sniffin' Sticks[13] a testování chuti.

Vzorky mikrobiomu: Výtěry z nosní dutiny a ústního hltanu budou odebrány pro analýzu mikrobiomů pomocí sekvenování nové generace zaměřené na 16S a 18S ribozomální RNA. Charakterizace mikrobiomu je prováděna metagenomikou na bázi 16S/18S amplikonu a data jsou analyzována různými bioinformatickými nástroji pro stanovení/vizualizaci alfa/beta diverzity a také analýzou hlavních souřadnic (PCoA).

Intranazální imunitní faktory: Nazální biopsie (3x3x3 mm) budou histologicky charakterizovány a analyzovány pomocí prostorové transkriptomiky na platformě Vision 10X Genomics. Nosní sekrece se odebírá pomocí šesti tamponů a používá se k charakterizaci cytokinového profilu. Bude použit široký panel na bázi Luminexu zahrnující 45 cytokinů a chemokinů (Invitrogen, Cyto-kin/Chemokine/Růstový faktor Convenience 45-Plex Human ProcartaPlex™ Panel 1) a vzorky budou zpracovány v duplikátech. Panel zahrnuje cytokiny, o kterých je známo, že hrají roli v CRS a na které se zaměřuje biologická léčba, jako je IL-4, IL-13 a IL-5.

Údaje o použití nazálních steroidů: Pacienti, kteří začínají s intranazálními glukokortikoidy, budou zařazeni po zahájení léčby a sledování bude probíhat po 24 týdnech.

Statistika: Při hodnotě alfa 5 % a síle 80 % by velikost populace pro každou skupinu měla být 42 účastníků, za předpokladu, že výskyt bakterií se mezi populacemi liší o 30 %. Vezmeme-li v úvahu 20% vyřazení, výzkumníci chtějí zahrnout 60 pacientů do skupiny 1-4. Studie zahrnující skupinu 5 a 6 jsou průzkumné a vytvářejí hypotézy a výpočty výkonu nebyly provedeny. Kromě toho jen málo pacientů splňuje kritéria pro biologickou léčbu; výzkumníci proto hodlají zahrnout všechny pacienty, kteří zahajují biologickou léčbu během 12-18 měsíců.

Proveditelnost: Projekt je spoluprací mezi žadatelem; profesor, hlavní konzultant, DMSc, Therese Ovesen, Flavour Institute, Aarhus University & The Flavour Clinic, Gødstrup Re-gional Hospital; a hlavní konzultant, DMSc, Kurt Fuursted, Statens Serum Institute (SSI). Flavour Institute přijímá pacienty z celého Dánska a od roku 2015 tuto jednotku navštívilo téměř 3000 pacientů a z Flavour Clinic and Institute bylo publikováno více než 50 výzkumných studií čichové dysfunkce. Od roku 2016 je na SSI prováděna rutinní klinická mikrobiomová diagnostika, metagenomika založená na 16S/18S amplikonu, a SSI bude v této oblasti poskytovat jak klinické, tak bioinformatické expertizy. Projekt dále využívá spolupráci s iniciativou CellX sídlící v MOMA, což je národní iniciativa poskytující odborné znalosti a infrastrukturu pro jednobuněčné omiky. Celkově se vyšetřovatelé zaručují jak za požadovaný počet pacientů, tak za solidní a rozsáhlé zkušenosti se všemi testovacími metodami, vybavením a nezbytnou infrastrukturou.

Regulační požadavky pro studii 1 a 2 jsou zavedeny a registrace pacientů i odběr vzorků mikrobiomu již začal.

Etika: Žádný z testů pachu nebo chuti, ani odběr vzorků mikrobiomu a imunitních faktorů nezpůsobuje nebezpečí, nepohodlí nebo bolest. GDPR je ve všech studiích dodržováno a data jsou ukládána na počítačích podle zákonných požadavků. Studie splňuje Helsinskou deklaraci a je schválena místní etickou komisí (reg.č. 1-10-72-213-21). Co se týče biopsií nosu, jedná se o rutinní práci v ORL ambulancích. Biopsie se odebírá ze střední torby v lokální anestezii a měří 3x3x3 mm. Místní etické komisi bude zaslána dodatečná žádost o povolení získat biopsie. Riziko krvácení je velmi nízké, protože jsou vyloučeni pacienti s hematologickým onemocněním a pacienti na antikoagulační léčbě.

Mikrobiom bude hodnocen pomocí výtěrů z nosní dutiny a analyzován pomocí sekvenování nové generace zacílené na 16S a 18S ribozomální RNA na oddělení bakterií, parazitů a hub ve Staten Serum Institute, Kodaň, Dánsko.

Nosní biopsie (3x3x3 mm) budou histologicky charakterizovány a analyzovány pomocí prostorové transkriptomiky na platformě Vision 10X Genomics. Nosní sekrece se odebírá pomocí šesti tamponů a používá se k charakterizaci cytokinového profilu.