El microbioma nasal y su importancia en las enfermedades

Hipótesis

Se sugieren las siguientes hipótesis nulas:

1. El microbioma nasal en pacientes con disfunción olfativa no difiere del de individuos sanos con olfato normal
2. No se producen fluctuaciones estacionales en el microbioma nasal.
3. El paisaje inmunológico de la mucosa nasal no se correlaciona con microbiomas específicos.
4. Ni los glucocorticoides intranasales ni dupilumab y mepolizumab afectan el microbioma nasal y los factores inmunes locales en pacientes con RSCcNP Materiales y métodos Diseño: Estudio de casos y controles y estudio de cohorte longitudinal.

Poblaciones:

1. 60 controles sanos: sentido del olfato normal y ausencia de enfermedad sinonasal, alergias de las vías respiratorias superiores y sin medicación intranasal.
2. 60 pacientes sin COVID-19 con disfunción olfativa
3. 15 pacientes positivos a COVID-19 en fase aguda
4. 60 pacientes con COVID-19 prolongado con disfunción olfativa que persiste durante más de 12 semanas
5. 60 pacientes con RSC inician glucocorticoides intranasales
6. 15 pacientes con SRC inician tratamiento biológico

Criterios de inclusión

- Mayor de 18 años

Criterio de exclusión

• Para los grupos de biopsia, tratamiento de anticoagulación activa.
• Enfermedades del sistema coagulante.
• Antibióticos en los últimos tres meses.
• Otros fármacos inmunomoduladores en los últimos tres meses.
• Enfermedad autoinmune o inmunodeficiencia.

Reclutamiento: Las poblaciones 1, 5 y 6 se reclutan entre pacientes sometidos a cirugía sinonasal en el departamento de otorrinolaringología del Hospital Regional Gødstrup, Dinamarca. Las poblaciones 2 y 4 están inscritas en el Instituto del Sabor, Departamento de Medicina Clínica de la Universidad de Aarhus, Dinamarca, y en la Clínica Universitaria para el Sabor, el Equilibrio y el Sueño del Hospital Regional de Gødstrup, Dinamarca. La población 3 se recluta en las clínicas largas de COVID-19 del Hospital Universitario de Aarhus y del Hospital Regional de Gødstrup. La población 1 se dotará de personal y estudiantes universitarios.

Exámenes clínicos, mediciones e información: Para todos los participantes, se obtiene información sobre el historial médico, el uso de medicamentos, el examen objetivo de oído, nariz y garganta, incluida la endoscopia de las vías respiratorias superiores, la prueba de resultado sino-nasal-22[9], la depresión mayor. Inventario[10,11], Mini estado mental[12], Sniffin' Sticks[13] y evaluación del gusto.

Muestras de microbioma: se recolectarán hisopos de la cavidad nasal y la faringe oral para el análisis del microbioma mediante secuenciación de próxima generación dirigida al ARN ribosomal 16S y 18S. La caracterización del microbioma se realiza mediante metagenómica basada en amplicones 16S/18S, y los datos se analizan mediante diversas herramientas bioinformáticas para la determinación/visualización de la diversidad alfa/beta, así como el análisis de coordenadas principales (PCoA).

Factores inmunes intranasales: las biopsias nasales (3x3x3 mm) se caracterizarán histológicamente y se analizarán mediante transcriptómica espacial en la plataforma Vision 10X Genomics. La secreción nasal se recoge mediante seis hisopos y se utiliza para caracterizar el perfil de citoquinas. Se empleará un amplio panel basado en Luminex que abarca 45 citocinas y quimiocinas (Invitrogen, Cyto-kine/Chemokine/Growth Factor Convenience 45-Plex Human ProcartaPlex™ Panel 1), y las muestras se analizarán por duplicado. El panel incluye citocinas que se sabe que desempeñan un papel en el RSC y que son el objetivo del tratamiento biológico, como IL-4, IL-13 e IL-5.

Datos sobre el uso de esteroides nasales: los pacientes que comienzan con glucocorticoides intranasales se incluirán al inicio del tratamiento y el seguimiento será después de 24 semanas.

Estadísticas: Con un alfa del 5% y una potencia del 80%, el tamaño de la población para cada grupo debe ser de 42 participantes, suponiendo que la aparición de bacterias difiere en un 30% entre poblaciones. Teniendo en cuenta el abandono del 20%, los investigadores pretenden incluir a 60 pacientes en el grupo 1-4. Los estudios que involucran a los grupos 5 y 6 son exploratorios y generadores de hipótesis, y no se han realizado cálculos de potencia. Además, sólo unos pocos pacientes cumplen los criterios para el tratamiento biológico; por lo tanto, los investigadores pretenden incluir a todos los pacientes que inicien el tratamiento biológico dentro de los 12 a 18 meses.

Viabilidad: El proyecto es una colaboración entre el solicitante; profesora, consultora senior, DMSc, Therese Ovesen, Flavor Institute, Universidad de Aarhus y The Flavor Clinic, Hospital Regional de Gødstrup; y consultor senior, DMSc, Kurt Fuursted, Statens Serum Institute (SSI). El Flavor Institute recibe pacientes de toda Dinamarca, y desde 2015 casi 3000 pacientes han consultado a la unidad, y la Clínica e Instituto Flavor han publicado más de 50 estudios de investigación sobre disfunción olfativa. Desde 2016, en SSI se realizan diagnósticos clínicos de microbioma de rutina, metagenómica basada en amplicones 16S/18S, y SSI proporcionará experiencia tanto clínica como bioinformática en este campo. El proyecto aprovecha además la colaboración con la iniciativa CellX ubicada en el MOMA, que es una iniciativa nacional que proporciona experiencia e infraestructura para ómicas unicelulares. En general, los investigadores garantizan tanto el número necesario de pacientes como una sólida y amplia experiencia en todos los métodos de prueba, equipos y la infraestructura necesaria.

Los requisitos reglamentarios para los estudios 1 y 2 ya están vigentes y ya ha comenzado la inscripción de pacientes y la recolección de muestras de microbioma.

Ética: Ninguna de las pruebas de olfato o gusto, ni las muestras de microbioma y factores inmunológicos causan peligro, malestar o dolor. En todos los estudios se cumple el RGPD y los datos se almacenan en ordenadores siguiendo los requisitos legales. El estudio cumple con la declaración de Helsinki y está aprobado por el comité de ética local (reg.nr. 1-10-72-213-21). En cuanto a las biopsias nasales, se trata de un trabajo de rutina en las consultas ambulatorias de otorrinolaringología. La biopsia se toma del cornete medio con anestesia local y mide 3x3x3 mm. Se enviará una solicitud adicional de permiso para obtener las biopsias al comité de ética local. El riesgo de hemorragia es muy bajo ya que se excluyen los pacientes con enfermedades hematológicas y los pacientes en tratamiento anticoagulante.

El microbioma se evaluará utilizando hisopos de la cavidad nasal y se analizará mediante secuenciación de próxima generación dirigida al ARN ribosomal 16S y 18S en el Departamento de Bacterias, Parásitos y Hongos del Staten Serum Institute, Copenhague, Dinamarca.

Las biopsias nasales (3x3x3 mm) se caracterizarán histológicamente y se analizarán mediante transcriptómica espacial en la plataforma Vision 10X Genomics. La secreción nasal se recoge mediante seis hisopos y se utiliza para caracterizar el perfil de citoquinas.