Mikrobiom nosa i jego znaczenie w chorobie

Hipotezy

Sugerowane są następujące hipotezy zerowe:

1. Mikrobiom nosa u pacjentów z dysfunkcją węchu nie różni się od mikrobiomu zdrowego węchu
2. Sezonowe wahania mikrobiomu nosa nie występują
3. Krajobraz immunologiczny błony śluzowej nosa nie koreluje ze specyficznymi mikrobiomami
4. Ani glikokortykosteroidy podawane donosowo, ani dupilumab i mepolizumab nie wpływają na mikrobiom nosa i lokalne czynniki odpornościowe u pacjentów z CRSwNP. Materiały i metody Projekt: Badanie kliniczno-kontrolne i podłużne badanie kohortowe.

Populacje:

1. 60 zdrowych kontroli: normalny węch i brak chorób zatok i nosa, alergie górnych dróg oddechowych i brak leków donosowych
2. 60 pacjentów innych niż COVID-19 z dysfunkcją węchu
3. 15 pacjentów z pozytywnym wynikiem na Covid-19 w ostrej fazie
4. 60 pacjentów z długotrwałą chorobą Covid-19 z dysfunkcją węchu utrzymującą się dłużej niż 12 tygodni
5. 60 pacjentów z CRS rozpoczynających podawanie glikokortykosteroidów donosowych
6. 15 pacjentów z CRS rozpoczynających leczenie biologiczne

Kryteria przyjęcia

- Starsze niż 18 lat

Kryteria wyłączenia

• Dla grup biopsyjnych aktywne leczenie przeciwzakrzepowe
• Choroby układu krzepnięcia
• Antybiotyki w ciągu ostatnich trzech miesięcy
• Inne leki immunomodulujące w ciągu ostatnich trzech miesięcy
• Choroba autoimmunologiczna lub niedobór odporności

Rekrutacja: Populacja 1, 5 i 6 jest rekrutowana spośród pacjentów poddawanych operacjom zatokowo-nosowym na oddziale ucha, nosa i gardła Szpitala Regionalnego Gødstrup w Danii. Populacje 2 i 4 zostały zarejestrowane w Instytucie Smaku, Wydziale Medycyny Klinicznej, Uniwersytetu w Aarhus, Dania, oraz Uniwersyteckiej Klinice Smaku, Równowagi i Snu, Szpitala Regionalnego Gødstrup, Dania. Populacja 3 jest rekrutowana w długich klinikach COVID-19 w Szpitalu Uniwersyteckim w Aarhus i Szpitalu Regionalnym Gødstrup. Populacja 1 zostanie zaopatrzona w pracowników i studentów.

Badania kliniczne, pomiary i informacje: W przypadku wszystkich uczestników uzyskiwane są informacje na temat historii choroby, stosowania leków, obiektywnych badań uszu, nosa i gardła, w tym endoskopii górnych dróg oddechowych, testu wyniku sino-nosowego-22 [9], dużej depresji Inwentarz[10,11], Mini Stan Psychiczny[12], Pałeczki do Wąchania[13] i badanie smaku.

Próbki mikrobiomu: Pobrane zostaną wymazy z jamy nosowej i gardła do analizy mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji ukierunkowanego na rybosomalny RNA 16S i 18S. Charakteryzację mikrobiomu przeprowadza się za pomocą metagenomiki opartej na amplikonach 16S/18S, a dane analizuje się za pomocą różnych narzędzi bioinformatycznych w celu określenia/wizualizacji różnorodności alfa/beta, a także analizy głównych współrzędnych (PCoA).

Donosowe czynniki odpornościowe: Biopsje nosa (3x3x3 mm) zostaną scharakteryzowane histologicznie i przeanalizowane przy użyciu transkryptomiki przestrzennej na platformie Vision 10X Genomics. Wydzielinę z nosa zbiera się za pomocą sześciu wymazów i wykorzystuje do scharakteryzowania profilu cytokin. Zastosowany zostanie szeroki panel oparty na Luminex obejmujący 45 cytokin i chemokin (Invitrogen, Cyto-kine/Chemokine/Growth Factor Convenience 45-Plex Human ProcartaPlex™ Panel 1), a próbki będą oznaczane w dwóch egzemplarzach. Panel obejmuje cytokiny, o których wiadomo, że odgrywają rolę w CRS i które są celem leczenia biologicznego, takie jak IL-4, IL-13 i IL-5.

Dane dotyczące stosowania steroidów donosowych: Pacjenci rozpoczynający leczenie glikokortykosteroidami donosowymi zostaną włączeni do badania po rozpoczęciu leczenia, a kontrola nastąpi po 24 tygodniach.

Statystyki: Przy współczynniku alfa wynoszącym 5% i mocy 80% wielkość populacji w każdej grupie powinna wynosić 42 uczestników, zakładając, że występowanie bakterii różni się w zależności od populacji o 30%. Biorąc pod uwagę 20% rezygnacji, badacze zamierzają włączyć 60 pacjentów do grup 1-4. Badania obejmujące grupę 5 i 6 mają charakter eksploracyjny i generujący hipotezy, a obliczenia mocy nie zostały przeprowadzone. Ponadto tylko nieliczni pacjenci spełniają kryteria leczenia biologicznego; stąd też badacze zamierzają uwzględnić w badaniu wszystkich pacjentów rozpoczynających leczenie biologiczne w ciągu 12–18 miesięcy.

Wykonalność: projekt jest efektem współpracy wnioskodawcy; profesor, starszy konsultant, DMSc, Therese Ovesen, Flavour Institute, Uniwersytet w Aarhus i The Flavour Clinic, Szpital Regionalny Gødstrup; oraz starszy konsultant, DMSc, Kurt Fuursted, Statens Serum Institute (SSI). Instytut Flavour przyjmuje pacjentów z całej Danii, od 2015 roku skorzystało z niego prawie 3000 pacjentów, a Klinika i Instytut Flavour opublikowało ponad 50 badań dotyczących dysfunkcji węchowych. Od 2016 roku w SSI prowadzona jest rutynowa diagnostyka mikrobiomu klinicznego, metagenomika oparta na amplikonach 16S/18S, a SSI zapewnia wiedzę kliniczną i bioinformatyczną w tej dziedzinie. Projekt wykorzystuje ponadto współpracę z inicjatywą CellX mieszczącą się w MOMA, która jest inicjatywą krajową zapewniającą wiedzę fachową i infrastrukturę na potrzeby omiki pojedynczych komórek. Ogólnie rzecz biorąc, badacze gwarantują zarówno wymaganą liczbę pacjentów, jak i solidne i rozległe doświadczenie w zakresie wszystkich metod badawczych, sprzętu i niezbędnej infrastruktury.

Obowiązują wymogi prawne dotyczące Badania 1 i 2, a rejestracja pacjentów i pobieranie próbek mikrobiomu już się rozpoczęły.

Etyka: Żadne badanie zapachu i smaku, ani pobieranie próbek mikrobiomu i czynników immunologicznych nie powoduje zagrożenia, dyskomfortu ani bólu. We wszystkich badaniach przestrzegane jest RODO, a dane są przechowywane na komputerach zgodnie z wymogami prawnymi. Badanie spełnia Deklarację Helsińską i zostało zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną (nr rej. 1-10-72-213-21). Jeśli chodzi o biopsję nosa, jest to rutynowe badanie w przychodniach laryngologicznych. Biopsja pobierana jest z małżowiny środkowej w znieczuleniu miejscowym i ma wymiary 3x3x3 mm. Dodatkowy wniosek o zgodę na pobranie biopsji zostanie przesłany do lokalnej komisji etycznej. Ryzyko krwawień jest bardzo niskie, ponieważ wykluczeni są pacjenci z chorobami hematologicznymi i pacjenci przyjmujący leki przeciwzakrzepowe.

Mikrobiom zostanie oceniony za pomocą wymazów z jamy nosowej i poddany analizie przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji ukierunkowanego na rybosomalny RNA 16S i 18S w Katedrze Bakterii, Pasożytów i Grzybów w Staten Serum Institute w Kopenhadze, Dania.

Biopsje nosa (3x3x3 mm) zostaną scharakteryzowane histologicznie i przeanalizowane przy użyciu transkryptomiki przestrzennej na platformie Vision 10X Genomics. Wydzielinę z nosa zbiera się za pomocą sześciu wymazów i wykorzystuje do scharakteryzowania profilu cytokin.