Enzymatické hodnocení neurotoxicity indukované celkovým anestetikem u pacientů s aneuryzmatickým subarachnoidálním krvácením

V rámci každé intervence (operace nebo endovaskulární coiling) bude do studie zařazeno šestnáct pacientů. Do studie bude přijato celkem třicet dva pacientů, kteří splňují kritéria pro zařazení. Pacienti budou randomizováni do čtyř skupin, kterým bude podáván Propofol (Skupina P), Isofluran (Skupina I), Sevofluran (Skupina S) nebo Desfluran (Skupina D) pomocí počítačově generovaného algoritmu pro udržování anestezie.

Chirurgii nebo endovaskulární coiling bude provádět zkušený neurochirurg nebo radiolog, který bude zaslepený vůči anestetiku používanému pro udržování anestezie. Před zákrokem bude provedeno předanestetické vyšetření. Pacient bude důkladně vyšetřen a všechna vyšetření budou přezkoumána. Písemný informovaný souhlas bude získán od nejbližších příbuzných pacienta.

PROTOKOL ANESTÉZIE:

K pacientům budou připojeny rutinní neinvazivní monitory. Bude zahrnovat neinvazivní krevní tlak (NIBP), srdeční frekvenci (HR), elektrokardiografii (EKG), pulzní oxymetrii (SpO2), oxid uhličitý na konci výdechu (EtCO2), stavovou entropii (SE) a výdej moči. Všichni pacienti budou předem nasyceni 10-15 ml/kg normálního fyziologického roztoku Fentanyl bude podáván intravenózně v dávce 2 µg/kg před indukcí a následně 0,5-2 µg/kg/hod jako infuze. Pacientům ve všech 4 skupinách bude indukována dávka propofolu 1 až 2 mg/kg, titrovaná do ztráty verbální odpovědi. K usnadnění tracheální intubace bude podáno vecuronium 0,1 mg/kg. Lignokain 1,5 mg/kg bude podán 120 sekund před laryngoskopií. Pro sledování krevního tlaku a analýzy krevních plynů bude po navození anestezie zaveden arteriální katétr. Pacienti budou udržováni podle skupinové alokace spolu s 50/50 % kyslíku/vzduchu. Monitorování BIS bude použito k udržení srovnatelné hloubky anestezie ve všech skupinách a bude titrováno tak, aby SE udrželo v rozmezí 40 až 60. Vecuronium bude podáváno přerušovaně, aby se udržely méně než dva záškuby při neurostimulaci. Tělesná teplota bude udržována pomocí přikrývky s nuceným oběhem vzduchu.

Jako intraoperační tekutina bude použit normální fyziologický roztok. PaCO2 se bude udržovat kolem 32-36 mmHg. Neuromuskulární blokáda bude zvrácena kombinací neostigminu 50 ug/kg a glykopyrolátu 10 ug/kg. Následně bude extubována průdušnice.

Pacienti, kteří nemohou být extubováni, budou převezeni na neurochirurgickou jednotku intenzivní péče pro elektivní ventilátorovou podporu.

Zaznamená se intraoperační hemodynamické monitorování, dočasný klips a případný výskyt ruptury aneuryzmatu. Vyboulení mozku v době odrazu duralu bude zaznamenáno. Stav pacienta bude posouzen na konci operace z hlediska extubace a neurologického stavu, tj. GCS.

STUDIJNÍ PROMĚNNÉ -

PŘEDOPERAČNÍ:

Budou zaznamenány demografické údaje pacienta, den iktusu, den přijetí do nemocnice, den operace, WFNS, Fischerovy stupně a případné komorbidity. Neurologické vyšetření včetně GCS a přítomnost nebo nepřítomnost jakéhokoli předoperačního neurologického deficitu bude také zaznamenána.

VNITŘNÍ OPERATIVNÍ:

Srdeční frekvence (HR), systolický krevní tlak (SBP), střední arteriální tlak (MAP), pulzní oxymetrie (SpO2), teplota a koncový dechový oxid uhličitý (EtCO2) budou zaznamenány v době indukce, intubace, incize, aplikace hlavové čepy, odraz kostní chlopně, Duralový odraz, oříznutí, Duralové uzavření, uzavření kůže a před ukončením anestezie. Srdeční frekvence a krevní tlak pacientů budou udržovány co nejblíže výchozí hodnotě. Jakékoli trvalé zvýšení TK o více než 30 % výchozích hodnot bude považováno za intraoperační hypertenzi. Hypotenze bude zvažována, pokud MAP < 70 mmHg nebo SBP < 90 mmHg. Léčba hypertenze nebo hypotenze bude na uvážení ošetřujícího anesteziologa.

Hodnocení relaxace mozku bude provedeno po odrazu kostní chlopně pomocí čtyřbodové stupnice. Bude zaznamenána dočasná doba vystřižení, peroperační ruptura aneuryzmatu, intraoperační intravenózní podání tekutiny, ztráta krve, výdej moči.

PROTOKOL PRO STUDIUM ENZYMŮ A ODHAD:

Pacientovi bude odebrán základní vzorek mozkomíšního moku (CSF) a krevní sérum. Základní likvor bude odebrán pomocí zavedeného lumbálního subarachnoidálního katétru umístěného před intervencí jako modalita k prevenci komplikací spojených s SAH, jako je vazospasmus, a k usnadnění drenáže SAH. Bude provedena venepunkce a 2 až 3 ml vzorku krve budou odebrány do obyčejné lahvičky pro sérum/EDTA pro plazmu. Druhý CSF a vzorek krve séra budou odebrány po 1 hodině vystavení anestezii. Třetí vzorek bude odebrán po dokončení intervence nebo po vysazení anestetika, podle toho, co nastane dříve.

Hladina enzymu kaspázy 3 by byla odhadnuta pomocí kvantitativní soupravy ELISA s předem potaženými jamkami s antigenem a známými standardy sendvičovou technikou s dvojitou protilátkou.

Odběr a skladování vzorků – Vzorky krve by se odebíraly do obyčejných lahviček/vakutainerů. Vzorky CSF by se odebíraly do kryozkumavek. Vzorky krve se nechají srážet při pokojové teplotě po dobu 1 hodiny. Sražená krev v prostých vakuových nádobách by se centrifugovala při 2000 otáčkách za minutu po dobu 15 minut, aby se oddělilo sérum. Sérum by bylo odpipetováno do kryozkumavek. Všechny vzorky by byly okamžitě skladovány při -80 °C až do další analýzy.

Odhad enzymu kaspázy 3 Při enzymatickém vyhodnocení budou následovat následující kroky:

1. Souprava ELISA skladovaná při 40 °C bude vyjmuta z lednice 20 minut před provedením testu, aby byla ekvilibrována na pokojovou teplotu.
2. Různé koncentrace standardů lidské kaspázy 3 se známými hodnotami a testovací vzorky s neznámými hodnotami by byly přidány do potažených jamek na předem potažené mikrodestičky.
3. Tekutina biotinylované lidské kaspázy 3, kapalina enzymového konjugátu a barvivo se připraví 30 minut před použitím
4. Destičky Elisa by se promyly 3krát přidáním 350 ul promývacího pufru do jamek a mezi promytími byly vysušeny na adsorbčních papírových utěrkách.
5. Biotinylovaná lidská kaspáza 3 se nyní přidá do každé jamky
6. Jamky se promyjí 3krát, jak je popsáno výše v kroku 4.
7. Tekutina enzymového konjugátu by se nyní přidala do jednotlivých jamek mikrodestičky
8. Jamky se promyjí 3krát, jak je popsáno výše v krocích 4 a 6 výše.
9. Přidá se barevné činidlo (roztok substrátu) a následně zastavovací roztok
10. Optická hustota by byla měřena při 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček ELISA
11. Hodnoty neznámých vzorků by byly odečteny ze standardní křivky vytvořené vynesením optických hustot známých standardů proti jejich známým koncentracím.