Vliv 2-týdenního cukrového stresu na bakteriální profily v celých slinách

Objektivní

Cílem této studie je prozkoumat bakteriální profily v celých slinách před a po 2týdenní cukrové provokaci s a bez probiotických doplňků u zdravých mladých dospělých. Druhým cílem je studovat bakteriální profily 3 týdny po ukončení cukrového stresu. Nulová hypotéza je:

1. Stres vyvolaný sacharózou neovlivňuje bakteriální profily v celých slinách ve srovnání se stresem vyvolaným nefermentovatelným pentitolem (xylitolem)
2. Příjem probiotických bakterií pocházejících z laktobacilů neovlivňuje změny v bakteriálním profilu v celých slinách vyvolané cukrem ve srovnání s placebem
3. Bakteriální profily ve slinách se neliší od výchozí hodnoty 3 týdny po ukončení intervence.

Materiál Studijní skupina se bude skládat z 80 mladých dospělých s neohroženým zdravím ústní dutiny, kteří se dobrovolně přihlásí po informovaném souhlasu. Kritéria pro zařazení jsou i) starší 18 let s více než 20 vlastními přirozenými zuby, ii) žádná chronická systémová onemocnění ovlivňující slinné funkce, iii) žádné léky kromě antikoncepce a iv) nekuřák. Projekt bude předložen k etickému schválení.

Návrh studie Studie bude využívat randomizovaný, trojitě zaslepený, placebem kontrolovaný design se čtyřmi paralelními rameny, jak je znázorněno na obrázku 1. Rozdělení do skupin bude uspořádáno prostřednictvím počítačově generovaných obálek a bude skryté pro všechny části (subjekty, vyšetřovatele, laboratorní personál). Po základní registraci (den 0) jsou účastníci požádáni, aby si vypláchli ústa 10 ml roztoku obsahujícího sacharózu nebo xylitol každou druhou hodinu (7-8krát denně) po dobu 14 dnů (den 14). Roztok by se měl „švihnout“ kolem a mezi zuby po dobu alespoň 30 sekund a poté vyplivnout. Není povoleno následné oplachování vodou. Kromě toho jsou subjektům poskytnuty tablety obsahující buď probiotické laktobacily nebo placebo pro každodenní použití během 14denního oplachovacího období. Účastníci budou důkladně poučeni o dodržování běžných stravovacích a pitných návyků a také o každodenních postupech ústní hygieny.

Intervence – probiotika a placebo Pastilky s aktivní látkou a placebem na 14denní intervenční období budou distribuovány účastníkům po základním vyšetření a odběru vzorků. Aktivní pastilky obsahují dva kmeny probiotických bakterií; Lactobacillus rhamnosus PB01 (DSM 14869) a Lactobacillus curvatus EB10 (DSM 32307), každý v koncentraci 109 jednotek tvořících kolonie. Tablety byly dříve použity v randomizované kontrolované studii se zánětem dásní a mikrobiálními cíli (Keller et al., 2018). Kompletní složení je uvedeno v příloze X. Placebo pastilky mají identické složení, kromě bakterií, se stejnou velikostí a chutí. Účastníci jsou instruováni, aby nechali jednu tabletu pomalu rozpustit v ústech dvakrát denně (ráno, večer) po pravidelném čištění zubů. Jsou také povinni vést denní deník obsahující výplachy cukru a příjem tablet a vrátit nespotřebovanou tabletu při první kontrole. Cukrové výplachy budou připraveny a distribuovány v neoznačených lahvích a účastníci budou vybaveni dávkovací lžičkou s označením 10 ml. Účastníci také dostanou standardizovanou fluoridovou zubní pastu, kterou budou používat během celé studie. Nezávislý pozorovatel na Kodaňské univerzitě zaručí utajení přidělení.

Klinické vyšetření a odběry slin Na začátku klinické vyšetření provádí jeden zkušený a kalibrovaný zubní lékař. Nejsou vystaveny žádné rentgenové snímky. Registrují se následující proměnné: a) kazivost vyjádřená jako zkažené, vynechané a plné zuby (DMFT), b) množství supragingiválního plaku (s-PI), c) úroveň zánětu dásní (s-GI) a d) krvácení při sondování (s-BOP). PI, GI a BOP budou skórovány zjednodušeným způsobem na šesti předem vybraných zubech a znovu vyhodnoceny při kontrolách po 14 a 35 dnech. Vzorky stimulovaných celých slin (přibližně 1,0 ml) budou odebírány na začátku a po 14 a 35 dnech standardizovaným způsobem jedním vyškoleným zkoušejícím. Všechny vzorky jsou až do dalšího zpracování skladovány při -80 °C.

Laboratorní postupy DNA bude extrahována pomocí protokolu Pathogen_Universal_200 (Roche) v souladu s pokyny výrobce v Institute for Inflammatory Research, Rigshospitalet, København, Dánsko. Profily slinného mikrobiomu budou analyzovány pomocí Next Generation Sequencing (NGS) a qPCR, jak bylo podrobně popsáno (Keller et al., 2018).

Koncové body Bakteriální profily slin budou analyzovány pomocí Human Oral Microbe Identification s využitím sekvenování nové generace (HOMINGS) ve spolupráci s Costertonovým centrem na Univerzitě v Kodani. Sekundárními koncovými body jsou zjednodušený index plaků (PI), gingivální index (GI) a krvácení při sondování (BOP) podle skóre po 15 a 35 dnech.

Statistické metody Všechna data budou zkontrolována na normalitu a zpracována pomocí softwaru IBM-SPSS. Klinická data se porovnávají pomocí Freidmanova testu s Dunnovým srovnáním. Relativní množství odečtů bakteriální DNA se porovnává mezi skupinami vzorků na úrovni rodu a druhu pomocí Kruskal-Wallisova a Mann-Whitneyho testu s Benjamini-Hochbergovou korekcí pro vícenásobné závislé analýzy. P-hodnoty menší než 0,05 budou považovány za statisticky významné.