Wpływ 2-tygodniowego stresu cukrowego na profile bakteryjne w całej ślinie

Cel

Celem tego badania jest zbadanie profili bakteryjnych w ślinie pełnej przed i po 2-tygodniowej prowokacji cukrem z suplementami probiotycznymi i bez nich u zdrowych młodych dorosłych. Drugim celem jest zbadanie profili bakteryjnych 3 tygodnie po zakończeniu stresu cukrowego. Hipotezą zerową są:

1. Stres wywołany sacharozą nie wpływa na profile bakteryjne w całej ślinie w porównaniu ze stresem wywołanym przez niefermentujący pentitol (ksylitol)
2. Spożycie bakterii probiotycznych pochodzących z pałeczek kwasu mlekowego nie wpływa na wywołane cukrem zmiany profili bakteryjnych w całej ślinie w porównaniu z placebo
3. Profile bakteryjne w ślinie nie odbiegają od wartości wyjściowych 3 tygodnie po zakończeniu interwencji.

Materiał Grupa badana będzie się składać z 80 młodych dorosłych z nienaruszonym zdrowiem jamy ustnej, którzy zgłoszą się na ochotnika po uzyskaniu świadomej zgody. Kryteriami włączenia są: i) powyżej 18 lat z ponad 20 własnymi zębami naturalnymi, ii) brak przewlekłych chorób ogólnoustrojowych wpływających na funkcje ślinianek, iii) brak przyjmowania leków z wyjątkiem środków antykoncepcyjnych oraz iv) niepalenie tytoniu. Projekt zostanie przedstawiony do zatwierdzenia etycznego.

Projekt badania W badaniu wykorzystany zostanie randomizowany, potrójnie ślepy, kontrolowany placebo projekt z czterema równoległymi ramionami, jak pokazano na rycinie 1. Przydział grup zostanie zorganizowany za pomocą wygenerowanych komputerowo kopert i ukryty dla wszystkich części (badanych, badaczy, personelu laboratorium). Po rejestracji wyjściowej (dzień 0) uczestnicy proszeni są o płukanie ust 10 ml roztworu zawierającego sacharozę lub ksylitol co drugą godzinę (7-8 razy dziennie) przez 14 dni (dzień 14). Roztwór należy „przecierać” wokół i między zębami przez co najmniej 30 sekund, a następnie wypluć. Niedopuszczalne jest późniejsze spłukiwanie wodą. Ponadto pacjentom podaje się tabletki zawierające albo probiotyczne pałeczki kwasu mlekowego albo placebo do codziennego stosowania podczas 14-dniowego okresu płukania. Uczestnicy zostaną dokładnie poinstruowani, jak zachować normalne nawyki żywieniowe i picie, a także codzienne procedury higieny jamy ustnej.

Interwencja – probiotyki i placebo Aktywne i placebo tabletki do ssania na 14-dniowy okres interwencji zostaną rozdane uczestnikom po badaniu wyjściowym i pobraniu próbek. Aktywne pastylki do ssania zawierają dwa szczepy bakterii probiotycznych; Lactobacillus rhamnosus PB01 (DSM 14869) i Lactobacillus curvatus EB10 (DSM 32307) w stężeniu po 109 jednostek tworzących kolonie każda. Tabletki były wcześniej używane w randomizowanym badaniu kontrolowanym dotyczącym zapalenia dziąseł i drobnoustrojowych punktów końcowych (Keller i in., 2018). Pełny skład przedstawiono w Załączniku X. Pastylki placebo mają identyczny skład, z wyjątkiem bakterii, o tej samej wielkości i smaku. Uczestnicy zostali poinstruowani, aby po regularnym szczotkowaniu zębów pozwolić jednej tabletce powoli rozpuścić się w jamie ustnej dwa razy dziennie (rano, wieczorem). Są również zobowiązani do prowadzenia dziennego dziennika obejmującego wypłukiwanie cukru i przyjmowanie tabletek oraz zwracanie niewykorzystanej tabletki podczas pierwszej wizyty kontrolnej. Płukanki cukrowe będą przygotowywane i rozprowadzane w nieoznakowanych butelkach, a uczestnicy otrzymają łyżeczkę dozującą z oznaczeniem 10 ml. Uczestnicy otrzymają również standaryzowaną pastę do zębów z fluorem do stosowania podczas całego badania. Niezależny monitor na Uniwersytecie w Kopenhadze zagwarantuje ukrycie alokacji.

Badanie kliniczne i pobieranie próbek śliny Na początku badania klinicznego przeprowadza jeden doświadczony i wykwalifikowany dentysta. Żadne zdjęcia rentgenowskie nie są eksponowane. Rejestrowane są następujące zmienne: a) doświadczenie próchnicy wyrażone jako zęby próchnicze, brakujące i wypełnione (DMFT), b) ilość płytki nazębnej naddziąsłowej (s-PI), c) stopień zapalenia dziąseł (s-GI), oraz d) krwawienie podczas sondowania (s-BOP). PI, GI i BOP zostaną ocenione w uproszczony sposób na sześciu wstępnie wybranych zębach i ponownie ocenione podczas wizyt kontrolnych po 14 i 35 dniach. Stymulowane próbki pełnej śliny (około 1,0 ml) zostaną pobrane na początku badania oraz po 14 i 35 dniach w wystandaryzowany sposób przez jednego przeszkolonego badacza. Wszystkie próbki przechowuje się w temperaturze -80°C do czasu dalszej obróbki.

Procedury laboratoryjne DNA zostanie wyekstrahowane przy użyciu protokołu Pathogen_Universal_200 (Roche) zgodnie z wytycznymi producenta w Institute for Inflammatory Research, Rigshospitalet, København, Danmark. Profile mikrobiomu śliny zostaną przeanalizowane za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS) i qPCR, zgodnie z cennym opisem (Keller i in., 2018).

Punkty końcowe Profile bakteryjne śliny zostaną przeanalizowane za pomocą identyfikacji drobnoustrojów jamy ustnej człowieka z wykorzystaniem sekwencjonowania nowej generacji (HOMINGS) we współpracy z Costerton Center na Uniwersytecie w Kopenhadze. Drugorzędowe punkty końcowe to uproszczony wskaźnik płytki nazębnej (PI), wskaźnik dziąseł (GI) i krwawienie podczas sondowania (BOP) oceniane po 15 i 35 dniach.

Metody statystyczne Wszystkie dane zostaną sprawdzone pod kątem normalności i przetworzone za pomocą oprogramowania IBM-SPSS. Dane kliniczne porównuje się za pomocą testu Freidmana z porównaniem Dunna. Względna obfitość odczytów bakteryjnego DNA jest porównywana między grupami próbek na poziomie rodzaju i gatunku przy użyciu testów Kruskala-Wallisa i Manna-Whitneya z poprawką Benjaminiego-Hochberga dla analiz wielozależnych. Wartości P mniejsze niż 0,05 będą uważane za istotne statystycznie.