Efecto de un estrés de azúcar de 2 semanas en los perfiles bacterianos en saliva entera

Objetivo

El objetivo de este estudio es investigar los perfiles bacterianos en la saliva total antes y después de una provocación de azúcar de 2 semanas con y sin suplementos probióticos en adultos jóvenes sanos. Un segundo objetivo es estudiar los perfiles bacterianos 3 semanas después de la terminación del estrés por azúcar. Las hipótesis nulas son:

1. El estrés inducido por sacarosa no afecta los perfiles bacterianos en la saliva total en comparación con el estrés inducido por un pentitol no fermentable (xilitol)
2. La ingesta de bacterias probióticas derivadas de lactobacilos no afecta los cambios inducidos por el azúcar en los perfiles bacterianos de la saliva total en comparación con el placebo
3. Los perfiles bacterianos en saliva no difieren de los basales 3 semanas después de finalizar la intervención.

Material El grupo de estudio estará formado por 80 adultos jóvenes con una salud bucodental intacta que se ofrecerán como voluntarios tras el consentimiento informado. Los criterios de inclusión son i) mayor de 18 años con más de 20 dientes naturales propios, ii) no tener enfermedades sistémicas crónicas que afecten las funciones salivales, iii) no tomar medicación excepto anticonceptivos, y iv) ser no fumador. El proyecto será sometido a aprobación ética.

Diseño del estudio El estudio empleará un diseño aleatorizado, triple ciego, controlado con placebo con cuatro brazos paralelos como se muestra en la Figura 1. La asignación de grupos se organizará a través de sobres generados por computadora y ocultos para todas las partes (sujetos, investigadores, personal de laboratorio). Después del registro inicial (Día 0), se pide a los participantes que se enjuaguen la boca con 10 ml de una solución que contenga sacarosa o xilitol cada dos horas (7-8 veces al día) durante 14 días (día 14). La solución debe "agitar" alrededor y entre los dientes durante al menos 30 segundos y luego escupirla. No se permite el enjuague posterior con agua. Además, los sujetos reciben tabletas que contienen lactobacilos probióticos o placebo para uso diario durante el período de enjuague de 14 días. Se instruirá minuciosamente a los participantes para que mantengan sus hábitos normales de alimentación y bebida, así como sus procedimientos diarios de higiene bucal.

Intervención: probióticos y placebo Las pastillas activas y de placebo para el período de intervención de 14 días se distribuirán a los participantes después del examen inicial y la toma de muestras. Las pastillas activas contienen dos cepas de bacterias probióticas; Lactobacillus rhamnosus PB01 (DSM 14869) y Lactobacillus curvatus EB10 (DSM 32307) a una concentración de 109 unidades formadoras de colonias cada uno. Las tabletas se usaron previamente en un ensayo controlado aleatorizado con inflamación gingival y criterios de valoración microbianos (Keller et al., 2018). La composición completa se muestra en el Apéndice X. Las pastillas de placebo tienen una composición idéntica, excepto por las bacterias, con el mismo tamaño y sabor. Se instruye a los participantes para que dejen que una tableta se disuelva lentamente en la boca dos veces al día (mañana, tarde) después de cepillarse los dientes con regularidad. También están obligados a llevar un registro diario que cubra los enjuagues de azúcar y la ingesta de tabletas y devolver las tabletas no consumidas en el primer seguimiento. Los enjuagues de azúcar se prepararán y distribuirán en botellas no rotuladas y se entregará a los participantes una cuchara dosificadora de 10 mL. Los participantes también recibirán una pasta dental con flúor estandarizada para usar durante todo el estudio. Un monitor independiente en la Universidad de Copenhague garantizará el ocultamiento de la asignación.

Examen clínico y muestras de saliva Al inicio del estudio, un dentista experimentado y calibrado realiza un examen clínico. No se exponen radiografías. Se registran las siguientes variables: a) la experiencia de caries, expresada como dientes cariados, perdidos y obturados (DMFT), b) la cantidad de placa supragingival (s-PI), c) el nivel de inflamación gingival (s-GI), y d) sangrado al sondaje (s-BOP). El PI, GI y BOP se calificarán de manera simplificada en seis dientes preseleccionados y se volverán a evaluar en los seguimientos después de 14 y 35 días. Un investigador capacitado recolectará muestras de saliva completa estimulada (aproximadamente 1,0 ml) al inicio y después de 14 y 35 días de manera estandarizada. Todas las muestras se almacenan a -80°C hasta su posterior procesamiento.

Procedimientos de laboratorio El ADN se extraerá utilizando un protocolo Pathogen_Universal_200 (Roche) de acuerdo con las directrices del fabricante en el Instituto de Investigación Inflamatoria, Rigshospitalet, København, Dinamarca. Los perfiles del microbioma salival se analizarán con Next Generation Sequencing (NGS) y qPCR como se describe con detalle (Keller et al., 2018).

Criterios de valoración Los perfiles de bacterias salivales se analizarán mediante la identificación de microbios orales humanos mediante secuenciación de próxima generación (HOMINGS) en cooperación con el Centro Costerton de la Universidad de Copenhague. Los criterios de valoración secundarios son el índice de placa simplificado (PI), el índice gingival (GI) y el sangrado al sondaje (BOP) según la puntuación después de 15 y 35 días.

Métodos estadísticos Se comprobará la normalidad de todos los datos y se procesarán con el software IBM-SPSS. Los datos clínicos se comparan usando la prueba de Freidman con la comparación de Dunn. La abundancia relativa de lecturas de ADN bacteriano se compara entre grupos de muestras a nivel de género y especie utilizando las pruebas de Kruskal-Wallis y Mann-Whitney con la corrección de Benjamini-Hochberg para análisis dependientes múltiples. Los valores de p inferiores a 0,05 se considerarán estadísticamente significativos.