Ætiologisk undersøgelse af Kawasakis sygdom

Patientvalg og familieovervågning: På National Taiwan University Hospital i Taiwan vil vi studere patienter, der opfylder kriterierne for Kawasaki sygdom eller atypisk Kawasaki sygdom og deres familiemedlemmer fra 2004 til december 2005. Institutional Review Board godkendelse vil blive opnået for denne undersøgelse, og informeret samtykke vil blive indhentet fra alle forsøgspersoner eller deres forældre. Hvis patienter på akutmodtagelsen, ambulatoriet eller indlæggelsesafdelingen havde kliniske syndromer, der tyder på EV71-infektion, blev de og deres familiemedlemmer bedt om at deltage i undersøgelsen. Hals- og rektalpodninger til virusisolering og den første blodprøve. Kliniske manifestationer, forløb og resultater blev registreret. Hvis de patienter, der var mistænkt for infektion, på noget tidspunkt udviste kliniske symptomer, blev de andre familiemedlemmer i samme husstand bedt om at gennemgå screening ved virusisolering af halspodninger og modtog den første blodprøve. Spørgeskemabaserede interviews blev brugt til at indsamle information, herunder demografiske data, antallet af soveværelser i husstanden, kontakttid, mønster og tilstedeværelse af aktuelle/nylige tegn og symptomer (hoste, rhinoré, ondt i halsen, udslæt, feber, mavesmerter og diarré ) og forudgående kontakthistorie med personer udenfor husstanden, som havde klinisk sygdom. Opfølgende telefoninterviews gentagne spørgsmål om tegn og symptomer med 2, 4 og 8 ugers mellemrum. Hvis et familiemedlem i husstanden rapporterede at opleve tegn eller symptomer, der tyder på Kawasakis sygdom under opfølgningsperioden, vil husstandsmedlemmet modtage yderligere klinisk vurdering og gentagne laboratorieundersøgelser for Kawasakis sygdom. En anden blodprøve blev taget fra KD-tilfældene og alle deres husstandsfamiliemedlemmer 4 uger efter den første blodprøve blev taget. Valg af kontroltilfælde: En kontrol, der matcher alder og køn, vil blive tilfældigt udvalgt. Kontrollen vil være de indlagte patienter på samme afdeling, som har andre diagnoser (såsom lungebetændelse, UVI, tonsillitis). De vil også modtage skærmen for virus- og bakteriebearbejdning, ligesom husstandsmedlemmerne gør.

Definitioner af Kawasaki sygdom og atypisk Kawasaki sygdom:

1. Kriterier for Kawasakis sygdom:

   • lig med eller over fem af følgende: feber i mere end 5 dage, ikke-purulent conjunctivitis, hududslæt, induration af håndflade/sål og erytem efterfulgt af afskalning, halslymfadenopati, jordbærtunge- eller læbefissur/blødning
2. Atypisk Kawasaki sygdom; mindre end fem af ovenstående, men med koronararterieaneurisme.

Laboratoriemetoder

1. Virusisolering og serotypning:

   Halspodninger, rektale podninger eller afføringsprøver blev indsendt til virusisolering. Prøver blev inokuleret i humane embryonale fibroblaster, LLC-MK2, HEp-2 og rhabdomyosarcoma (RD) cellekulturer. Når cytopatisk effekt involverede mere end 50% af cellemonolaget, blev cellerne skrabet og udsat for indirekte fluorescerende antistoffarvning med specifikke antistoffer (Chemicon International Inc., Temecula, CA) eller typebestemt ved specifikke metoder i henhold til de formodede typer af vira.

2. Molekylær diagnose for vira eller andre patogener, der er vanskelige at dyrke:

   1. Viral RNA- og RNA-ekstraktion: RNA- og DNA-ekstraktion vil blive udført ved at bruge Isolation Kit i henhold til producentens vejledning. (RNA-ekstraktionssæt, Qiagen). 140 µl halspodning blev blandet med AVL-buffer i 10 til 15 minutter ved stuetemperatur. Drej derefter blandingen ned. Tilsæt 560 uL 100 % alkohol til pelleten og inkuber i mindst 10 minutter ved stuetemperatur. Blandingen anbringes i spin-kolonnen og centrifugeres ved 8000 rpm i 1 minut to gange. Derefter tilsættes 500 µl AW1-buffer, og blandingen centrifugeres ved 80000 rpm i 1 minut, og derefter tilsættes 500 µl AW2-buffer og centrifugeres ved 14000 rpm i 3 minutter. Kassér opløsningen og centrifuger ved 14000 rpm i 2 minutter. Til sidst tilsættes 25 til 30 uL AVE-buffer og centrifugeres ved 8000 til 10000 rpm i 1 minut.
   2. Revers transkription: RT vil blive udført med 1. streng cDNA Synthesis Kit til RT-PCR (Roche). Bland det tidligere ekstraherede RNA med reagenser inklusive buffer, MgCl2, dNTP, Oligo-p(dT)15-primer, RNase-hæmmer, revers transkriptase, vortex kortvarigt, inkuber reaktionen ved 25oC i 10 minutter og derefter 42oC i 60 minutter. Inkuber til sidst ved 99oC i 5 minutter og afkøl derefter til 4oC i 5 minutter.
   3. Real-time TagMan PCR til enterovirus, adenovirus eller anden viral ætiologi. Primerne og proberne for enterovirus og anden virus i realtid PCR er i følgende tabel. Primere og prober for PanEV blev udvalgt baseret på stærkt konserverede regioner i den 5'-utranslaterede region af enterovirusgenomet. Primerne og proberne for EV71 blev udvalgt baseret på de mest forskellige og specifikke genetiske regioner i VP1-regionen af ​​enterovirusgenomet. Andre potentielle vira, såsom adenovirus, eller andre respiratoriske vira vil også blive udført ved PCR eller RT-PCR eller real-time PCR efter reglerne i ovenstående procedurer.
   4. Repræsentativ differentiel analyse efterfulgt af subtraktiv kloning
3. Bakteriekulturer og toksinpåvisning: Kulturer blev opnået fra svælget og endetarmen hos patienter med akut KD før starten af ​​den intravenøse infusion af immunglobulin og fra kontrolpatienter med brug af et Baxter Diagnostics Culturette-system, der indeholder en vatpind. Det primære dataindsamlingsark blev udfyldt og opbevaret på det sted, hvor prøverne blev taget. Pladerne blev derefter undersøgt for alle â-hæmolytiske gruppe A streptokokker og alle S aureus, der var koagulase positive ved rørtesten. Disse isolater blev derefter screenet på en blind måde for tilstedeværelsen af ​​bakteriel superantigenproduktion ved immundiffusion med antisera mod kendte stafylokokker og streptokoksuperantigener som beskrevet tidligere. (Lee PK og Schlieveret PM).
4. Serologisk test: Serologiske test til antistofpåvisning af Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO vil blive målt med kommercielle kits. Neutraliserende antistof for enterovirus vil blive udført ved standardprotokol for neutralisationstesten på mikrotiterplader. EV71 isolat TW/2272/98 blev amplificeret og oprenset som et antigen til m-capture ELISA til EV71 IgM Detektion. Hvis potentielt patogen er defineret, vil yderligere serologisk test for det specifikke patogen blive udført senere.
5. Statistisk analyse: Data blev analyseret med SAS Statistical Package (Version 8.2, SAS Institute, Cary, North Carolina). Vi brugte Students t-test til kontinuerte variable og c 2-test til kategoriske data. Efter univariat analyse screenet statistisk signifikante variabler, fremad trinvis multipel logistisk regressionsanalyse blev udført for at justere confounders samtidigt og for at beregne multivariat-justerede odds-forhold. Niveauet for modelvalg blev sat til 0,15 for ind-og-ud-modeller. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.