Estudo da Etiologia da Doença de Kawasaki

Seleção de pacientes e vigilância familiar: No National Taiwan University Hospital, em Taiwan, estudaremos pacientes que preenchem os critérios da doença de Kawasaki ou doença atípica de Kawasaki e seus familiares de 2004 a dezembro de 2005. A aprovação do Conselho de Revisão Institucional será obtida para este estudo e os consentimentos informados serão obtidos de todos os indivíduos ou de seus pais. Se os pacientes do serviço de emergência, ambulatório ou enfermaria de internação apresentassem síndromes clínicas sugestivas de infecção por EV71, eles e seus familiares eram convidados a participar do estudo. Swabs de garganta e reto para isolamento do vírus e a primeira amostra de sangue. Manifestações clínicas, cursos e resultados foram registrados. Se em algum momento os pacientes com suspeita de infecção apresentassem sintomas clínicos, os demais membros da família do mesmo domicílio eram solicitados a fazer a triagem por isolamento viral de swabs de garganta e recebiam a primeira amostra de sangue. Entrevistas baseadas em questionário foram usadas para coletar informações, incluindo dados demográficos, número de quartos na casa, tempo de contato, padrão e presença de sinais e sintomas atuais/recentes (tosse, rinorreia, dor de garganta, erupção cutânea, febre, dor abdominal e diarreia ) e história de contato anterior com pessoas extradomiciliares que apresentaram doença clínica. Entrevistas telefônicas de acompanhamento repetiram perguntas sobre sinais e sintomas em intervalos de 2, 4 e 8 semanas. Se algum membro da família relatar sinais ou sintomas sugestivos da doença de Kawasaki durante o período de acompanhamento, o membro da família receberá avaliação clínica adicional e investigação laboratorial repetida para a doença de Kawasaki. Uma segunda amostra de sangue foi obtida dos casos de KD e de todos os seus familiares 4 semanas após a primeira amostra de sangue ter sido obtida. Seleção de caso de controle: Um controle pareado por idade e sexo será selecionado aleatoriamente. O controle serão os pacientes internados na mesma enfermaria que tiverem outros diagnósticos (como pneumonia, ITU, amigdalite). Eles também receberão a triagem para análise de vírus e bactérias, como fazem os membros da família.

Definições de doença de Kawasaki e doença atípica de Kawasaki:

1. Critérios para a doença de Kawasaki:

   • igual ou superior a cinco dos seguintes: febre por mais de 5 dias, conjuntivite não purulenta, erupção cutânea, endurecimento da palma/sola dos pés e eritema seguido de descamação, linfadenopatia cervical, língua em morango ou fissura/sangramento labial
2. Doença de Kawasaki atípica; menos de cinco dos acima, mas com aneurisma de artéria coronária.

Métodos de Laboratório

1. Isolamento de vírus e sorotipagem:

   Swabs de garganta, swabs retais ou amostras de fezes foram enviados para isolamento do vírus. As amostras foram inoculadas em fibroblastos embrionários humanos, LLC-MK2, HEp-2 e culturas de células de rabdomiossarcoma (RD). Quando o efeito citopático envolveu mais de 50% da monocamada celular, as células foram raspadas e submetidas a coloração de anticorpo fluorescente indireta com anticorpos específicos (Chemicon International Inc., Temecula, CA) ou tipadas por métodos específicos de acordo com os tipos de vírus suspeitos.

2. Diagnóstico molecular para vírus ou outros patógenos difíceis de serem cultivados:

   1. Extração de RNA e RNA viral: A extração de RNA e DNA será realizada com o uso do Isolation Kit de acordo com o guia do fabricante. (kit de extração de RNA, Qiagen). 140 uL de swab de garganta foram misturados com tampão AVL por 10 a 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, gire a mistura. Adicionar 560 uL de álcool 100% no pellet e incubar por pelo menos 10 minutos em temperatura ambiente. A mistura será colocada na coluna giratória e centrifugada a 8000 rpm por 1 minuto duas vezes. Em seguida, serão adicionados 500uL de tampão AW1 e a mistura será centrifugada a 80000 rpm por 1 minuto, em seguida serão adicionados 500uL de tampão AW2 e centrifugada a 14000 rpm por 3 minutos. Descarte a solução e centrifugue a 14.000 rpm por 2 minutos. Finalmente, 25 a 30 uL de tampão AVE serão adicionados e centrifugados a 8000 a 10000 rpm por 1 minuto.
   2. Transcrição reversa: A RT será realizada com o Kit de Síntese de 1ª fita de cDNA para RT-PCR (Roche). Misture o RNA previamente extraído com reagentes incluindo tampão, MgCl2, dNTP, primer Oligo-p(dT)15, inibidor de RNase, transcriptase reversa, vórtice brevemente, incube a reação a 25oC por 10 minutos e depois a 42oC por 60 minutos. Finalmente, incubar a 99oC por 5 minutos e depois resfriar a 4oC por 5 minutos.
   3. PCR TagMan em tempo real para enterovírus, adenovírus ou outra etiologia viral. Os primers e sondas para PCR em tempo real de enterovírus e outros vírus estão na tabela a seguir. Primers e sondas para PanEV foram selecionados com base em regiões altamente conservadas na região 5' não traduzida do genoma do enterovírus. Os primers e sondas para EV71 foram selecionados com base nas mais diversas e específicas regiões genéticas da região VP1 do genoma do enterovírus. Outros vírus potenciais, como adenovírus ou outros vírus respiratórios também serão realizados por PCR ou RT-PCR ou PCR em tempo real seguindo as regras dos procedimentos acima.
   4. Análise diferencial representacional seguida de clonagem subtrativa
3. Culturas bacterianas e detecção de toxinas: Culturas foram obtidas da faringe e reto de pacientes com DK aguda antes do início da infusão intravenosa de imunoglobulina e de pacientes controle com o uso de um sistema Baxter Diagnostics Culturette que contém um cotonete. A ficha de coleta de dados primários foi preenchida e mantida no local onde os espécimes foram obtidos. As placas foram então examinadas para todos os estreptococos do grupo A hemolítico e todos os S aureus que eram coagulase positivos pelo teste do tubo. Esses isolados foram então rastreados de forma cega quanto à presença de produção de superantígenos bacterianos por imunodifusão com antissoros contra superantígenos estafilocócicos e estreptocócicos conhecidos, conforme descrito anteriormente. (Lee PK e Schlieveret PM).
4. Teste sorológico: Testes sorológicos para detecção de anticorpos de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO serão medidos por kits comerciais. O anticorpo neutralizante para enterovírus será realizado pelo protocolo padrão do teste de neutralização em placas de microtitulação. O isolado EV71 TW/2272/98 foi amplificado e purificado como um antígeno para m-capture ELISA para detecção de EV71 IgM. Se o patógeno potencial for definido, mais testes de sorologia para o patógeno específico serão feitos posteriormente.
5. Análise Estatística: Os dados foram analisados ​​com o SAS Statistical Package (Versão 8.2, SAS Institute, Cary, Carolina do Norte). Utilizamos o teste t de Student para variáveis ​​contínuas e o teste c 2 para dados categóricos. Depois que a análise univariada examinou as variáveis ​​estatisticamente significativas, a análise de regressão logística múltipla forward stepwise foi realizada para ajustar os fatores de confusão simultaneamente e para calcular as razões de chances ajustadas multivariadas. O nível de seleção de modelo foi definido em 0,15 para modelos de entrada e saída. P < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.