Étude étiologique de la maladie de Kawasaki

Sélection des patients et surveillance de la famille : À l'hôpital universitaire national de Taiwan à Taiwan, nous étudierons les patients qui remplissent les critères de la maladie de Kawasaki ou de la maladie de Kawasaki atypique et les membres de leur famille de 2004 à décembre 2005. L'approbation du comité d'examen institutionnel sera obtenue pour cette étude et des consentements éclairés seront obtenus de tous les sujets ou de leurs parents. Si les patients du service d'urgence, de la clinique externe ou du service d'hospitalisation présentaient des syndromes cliniques évocateurs d'une infection à EV71, ils et les membres de leur famille étaient invités à participer à l'étude. Écouvillons de gorge et rectaux pour l'isolement du virus, et le premier échantillon de sang. Les manifestations cliniques, les évolutions et les résultats ont été enregistrés. Si, à un moment donné, les patients suspectés d'infection présentaient des symptômes cliniques, les autres membres de la famille du même ménage étaient invités à subir un dépistage par isolement viral de prélèvements de gorge et recevaient le premier échantillon de sang. Des entretiens basés sur des questionnaires ont été utilisés pour collecter des informations, notamment des données démographiques, le nombre de chambres à coucher dans le ménage, le temps de contact, le schéma et la présence de signes et symptômes actuels/récents (toux, rhinorrhée, mal de gorge, éruption cutanée, fièvre, douleurs abdominales et diarrhée). ) et des antécédents de contact avec des personnes extérieures au ménage qui avaient une maladie clinique. Des entretiens téléphoniques de suivi ont répété des questions sur les signes et les symptômes à des intervalles de 2, 4 et 8 semaines. Si un membre de la famille du ménage a déclaré avoir présenté des signes ou des symptômes évocateurs de la maladie de Kawasaki au cours de la période de suivi, le membre du ménage recevra une évaluation clinique supplémentaire et des investigations de laboratoire répétées pour la maladie de Kawasaki. Un deuxième échantillon de sang a été obtenu des cas KD et de tous les membres de leur famille 4 semaines après l'obtention du premier échantillon de sang. Sélection des cas témoins : Un témoin apparié selon l'âge et le sexe sera sélectionné au hasard. Le témoin sera les patients admis dans le même service qui ont d'autres diagnostics (tels que pneumonie, infection urinaire, amygdalite). Ils recevront également le dépistage des virus et des bactéries comme le font les membres du ménage.

Définitions de la maladie de Kawasaki et de la maladie de Kawasaki atypique :

1. Critères de la maladie de Kawasaki :

   • égal ou supérieur à cinq des éléments suivants : fièvre pendant plus de 5 jours, conjonctivite non purulente, éruption cutanée, induration de la paume/de la plante des pieds et érythème suivi d'une desquamation, lymphadénopathie du cou, langue de fraise ou fissure/saignement des lèvres
2. Maladie de Kawasaki atypique ; moins de cinq des ci-dessus mais avec un anévrisme de l'artère coronaire.

Méthodes de laboratoire

1. Isolement et sérotypage du virus :

   Des écouvillons de gorge, des écouvillons rectaux ou des échantillons de selles ont été soumis pour l'isolement du virus. Des échantillons ont été inoculés dans des cultures de fibroblastes embryonnaires humains, LLC-MK2, HEp-2 et de rhabdomyosarcome (RD). Lorsque l'effet cytopathique impliquait plus de 50% de la monocouche cellulaire, les cellules étaient grattées et soumises à une coloration indirecte par anticorps fluorescent avec des anticorps spécifiques (Chemicon International Inc., Temecula, CA) ou typées par des méthodes spécifiques selon les types de virus suspectés.

2. Diagnostic moléculaire des virus ou autres pathogènes difficiles à cultiver :

   1. Extraction de l'ARN viral et de l'ARN : L'extraction de l'ARN et de l'ADN sera effectuée à l'aide du kit d'isolement conformément au guide du fabricant. (Kit d'extraction d'ARN, Qiagen). 140 ul d'écouvillon de gorge ont été mélangés avec du tampon AVL pendant 10 à 15 minutes à température ambiante. Ensuite, faites tourner le mélange. Ajouter 560 ul d'alcool à 100 % dans le culot et incuber pendant au moins 10 minutes à température ambiante. Le mélange sera placé dans la colonne de centrifugation et centrifugé à 8000 tr/min pendant 1 minute deux fois. Ensuite, 500 µL de tampon AW1 seront ajoutés et le mélange sera centrifugé à 80 000 tr/min pendant 1 minute, puis 500 µL de tampon AW2 seront ajoutés et centrifugés à 14 000 tr/min pendant 3 minutes. Jeter la solution et centrifuger à 14 000 tr/min pendant 2 minutes. Enfin, 25 à 30 µL de tampon AVE seront ajoutés et centrifugés à 8000 à 10000 rpm pendant 1 minute.
   2. Transcription inverse : la RT sera effectuée avec le kit de synthèse d'ADNc 1er brin pour RT-PCR (Roche). Mélanger l'ARN précédemment extrait avec des réactifs comprenant un tampon, MgCl2, dNTP, amorce Oligo-p(dT)15, inhibiteur de RNase, transcriptase inverse, vortexer brièvement, incuber la réaction à 25oC pendant 10 minutes puis à 42oC pendant 60 minutes. Enfin incuber à 99oC pendant 5 minutes puis refroidir à 4oC pendant 5 minutes.
   3. PCR TagMan en temps réel pour entérovirus, adénovirus ou autre étiologie virale. Les amorces et les sondes pour la PCR en temps réel d'entérovirus et d'autres virus sont dans le tableau suivant. Des amorces et des sondes pour PanEV ont été sélectionnées sur la base de régions hautement conservées dans la région non traduite en 5' du génome de l'entérovirus. Les amorces et les sondes pour EV71 ont été sélectionnées sur la base des régions génétiques les plus diverses et spécifiques de la région VP1 du génome de l'entérovirus. D'autres virus potentiels, tels que l'adénovirus, ou d'autres virus respiratoires seront également effectués par PCR ou RT-PCR ou PCR en temps réel en suivant les règles des procédures ci-dessus.
   4. Analyse différentielle représentationnelle suivie d'un clonage soustractif
3. Cultures bactériennes et détection des toxines : des cultures ont été obtenues à partir du pharynx et du rectum de patients atteints de MK aiguë avant le début de la perfusion intraveineuse d'immunoglobulines et de patients témoins à l'aide d'un système Baxter Diagnostics Culturette contenant un coton-tige. La fiche de collecte des données primaires a été remplie et conservée sur le site où les échantillons ont été obtenus. Les plaques ont ensuite été examinées pour tous les streptocoques β-hémolytiques du groupe A et tous les S aureus qui étaient coagulase positifs par le test en tube. Ces isolats ont ensuite été criblés en aveugle pour la présence de production de superantigènes bactériens par immunodiffusion avec des antisérums contre des superantigènes staphylococciques et streptococciques connus comme décrit précédemment. (Lee PK et Schlieveret PM).
4. Test sérologique : Les tests sérologiques pour la détection des anticorps de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO seront mesurés par des kits commerciaux. La neutralisation des anticorps pour entérovirus sera réalisée selon le protocole standard du test de neutralisation sur plaques de microtitration. L'isolat EV71 TW/2272/98 a été amplifié et purifié en tant qu'antigène pour la méthode ELISA m-capture pour la détection des IgM EV71. Si un agent pathogène potentiel est défini, un test sérologique supplémentaire pour l'agent pathogène spécifique sera effectué ultérieurement.
5. Analyse statistique : Les données ont été analysées avec le SAS Statistical Package (Version 8.2, SAS Institute, Cary, Caroline du Nord). Nous avons utilisé le test t de Student pour les variables continues et le test c 2 pour les données catégorielles. Après une analyse univariée des variables statistiquement significatives, une analyse de régression logistique multiple progressive a été effectuée pour ajuster les facteurs de confusion simultanément et pour calculer les rapports de cotes ajustés multivariés. Le niveau de sélection des modèles a été fixé à 0,15 pour les modèles in-and-out. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.