Etiologiestudie van de ziekte van Kawasaki

Patiëntselectie en familiesurveillance: in het National Taiwan University Hospital in Taiwan zullen we patiënten bestuderen die voldoen aan de criteria van de ziekte van Kawasaki of de atypische ziekte van Kawasaki en hun gezinsleden van 2004 tot december 2005. Goedkeuring van de Institutional Review Board zal worden verkregen voor deze studie en geïnformeerde toestemming zal worden verkregen van alle proefpersonen of hun ouders. Als patiënten op de spoedeisende hulp, polikliniek of klinische afdeling klinische syndromen hadden die wezen op een EV71-infectie, werden zij en hun gezinsleden gevraagd om deel te nemen aan het onderzoek. Keel- en rectumuitstrijkjes voor virusisolatie en het eerste bloedmonster. Klinische manifestaties, beloop en uitkomsten werden geregistreerd. Als de van infectie verdachte patiënten op enig moment klinische symptomen vertoonden, werd de andere familieleden in hetzelfde huishouden gevraagd om screening te ondergaan door middel van virusisolatie van keeluitstrijkjes en ontvingen ze het eerste bloedmonster. Op vragenlijsten gebaseerde interviews werden gebruikt om informatie te verzamelen, waaronder demografische gegevens, het aantal slaapkamers in het huishouden, contacttijd, patroon en aanwezigheid van huidige/recente tekenen en symptomen (hoesten, loopneus, keelpijn, huiduitslag, koorts, buikpijn en diarree ) en eerdere contactgeschiedenis met mensen buiten het huishouden die een klinische ziekte hadden. Follow-up telefonische interviews herhaalde vragen over tekenen en symptomen met tussenpozen van 2, 4 en 8 weken. Als een gezinslid aangaf tekenen of symptomen te ervaren die wijzen op de ziekte van Kawasaki tijdens de follow-upperiode, zal het gezinslid verder klinisch worden beoordeeld en herhaald laboratoriumonderzoek naar de ziekte van Kawasaki ondergaan. Een tweede bloedmonster werd verkregen van de KD-gevallen en al hun gezinsleden 4 weken nadat het eerste bloedmonster was verkregen. Selectie controlegeval: Er wordt willekeurig een op leeftijd en geslacht afgestemde controle geselecteerd. De controle zijn de opgenomen patiënten op dezelfde afdeling met andere diagnoses (zoals longontsteking, urineweginfecties, amandelontsteking). Ze krijgen ook het scherm voor virus- en bacteriële opwerking, net als de leden van het huishouden.

Definities van de ziekte van Kawasaki en atypische ziekte van Kawasaki:

1. Criteria voor de ziekte van Kawasaki:

   • gelijk aan of meer dan vijf van de volgende: koorts gedurende meer dan 5 dagen, niet-purulente conjunctivitis, huiduitslag, handpalm-/zoolverharding en erytheem gevolgd door desquamatie, halslymfadenopathie, aardbeitong of lipscheuring/bloeding
2. Atypische ziekte van Kawasaki; minder dan vijf van de bovenstaande, maar met een aneurysma van de kransslagader.

Laboratoriummethoden

1. Virusisolatie en serotypering:

   Er werden keeluitstrijkjes, rectale uitstrijkjes of ontlastingsmonsters opgestuurd voor virusisolatie. Monsters werden geïnoculeerd in menselijke embryonale fibroblast-, LLC-MK2-, HEp-2- en rhabdomyosarcoom (RD) celculturen. Wanneer het cytopathische effect meer dan 50% van de celmonolaag betrof, werden de cellen geschraapt en onderworpen aan indirecte fluorescerende antilichaamkleuring met specifieke antilichamen (Chemicon International Inc., Temecula, CA) of getypeerd met specifieke methoden volgens de vermoedelijke virustypen.

2. Moleculaire diagnose voor virussen of andere ziekteverwekkers die moeilijk te cultiveren zijn:

   1. Virale RNA- en RNA-extractie: RNA- en DNA-extractie wordt uitgevoerd met behulp van de isolatiekit volgens de handleiding van de fabrikant. (RNA-extractiekit, Qiagen). 140 µl keeluitstrijkje werd gemengd met AVL-buffer gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur. Draai vervolgens het mengsel naar beneden. Voeg 560 uL 100% alcohol toe aan de pellet en incubeer gedurende minstens 10 minuten bij kamertemperatuur. Het mengsel wordt in de spinkolom gebracht en tweemaal 1 minuut gecentrifugeerd bij 8000 rpm. Vervolgens wordt 500 µL AW1-buffer toegevoegd en wordt het mengsel gedurende 1 minuut bij 80.000 rpm gecentrifugeerd, waarna 500 µL AW2-buffer wordt toegevoegd en gedurende 3 minuten bij 14.000 rpm wordt gecentrifugeerd. Gooi de oplossing weg en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 14.000 tpm. Ten slotte wordt 25 tot 30 µl AVE-buffer toegevoegd en gedurende 1 minuut gecentrifugeerd bij 8000 tot 10000 rpm.
   2. Omgekeerde transcriptie: RT zal worden uitgevoerd met 1e streng cDNA-synthesekit voor RT-PCR (Roche). Meng het eerder geëxtraheerde RNA met reagentia waaronder buffer, MgCl2, dNTP, Oligo-p(dT)15-primer, RNase-remmer, reverse transcriptase, kort vortexen, incubeer de reactie bij 25oC gedurende 10 minuten en vervolgens 42oC gedurende 60 minuten. Ten slotte 5 minuten incuberen bij 99oC en daarna 5 minuten afkoelen tot 4oC.
   3. Real-time TagMan PCR voor enterovirus, adenovirus of andere virale etiologie. De primers en probes voor enterovirus en andere virus real-time PCR staan ​​in de volgende tabel. Primers en probes voor PanEV werden geselecteerd op basis van sterk geconserveerde gebieden in het 5'-onvertaalde gebied van het enterovirusgenoom. De primers en probes voor EV71 werden geselecteerd op basis van de meest uiteenlopende en specifieke genetische regio's in de VP1-regio van het enterovirusgenoom. Andere potentiële virussen, zoals adenovirus, of andere respiratoire virussen zullen ook worden uitgevoerd door PCR of RT-PCR of real-time PCR volgens de regels van de bovenstaande procedures.
   4. Representatieve differentiële analyse gevolgd door subtractief klonen
3. Bacterieculturen en toxinedetectie: Culturen werden verkregen uit de keelholte en het rectum van patiënten met acute KD vóór de start van de intraveneuze infusie van immunoglobuline en van controlepatiënten met behulp van een Baxter Diagnostics Culturette-systeem dat een wattenstaafje bevat. Het blad voor het verzamelen van primaire gegevens werd ingevuld en bewaard op de plaats waar de monsters werden verkregen. De platen werden vervolgens onderzocht op alle a-hemolytische groep A-streptokokken en alle S aureus die coagulase-positief waren door de buistest. Deze isolaten werden vervolgens geblindeerd gescreend op de aanwezigheid van bacteriële superantigeenproductie door immunodiffusie met antisera tegen bekende stafylokokken- en streptokokkensuperantigenen, zoals eerder beschreven. (Lee PK en Schlieveret PM).
4. Serologische test: Serologische tests voor antilichaamdetectie van Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO zullen worden gemeten met commerciële kits. Neutraliserend antilichaam voor enterovirus zal worden uitgevoerd volgens het standaardprotocol van de neutralisatietest op microtiterplaten. EV71-isolaat TW/2272/98 werd geamplificeerd en gezuiverd als een antigeen voor m-capture ELISA voor EV71 IgM-detectie. Als een potentiële ziekteverwekker is gedefinieerd, zal later een verdere serologische test voor de specifieke ziekteverwekker worden uitgevoerd.
5. Statistische analyse: gegevens werden geanalyseerd met het SAS Statistical Package (versie 8.2, SAS Institute, Cary, North Carolina). We gebruikten Student's t-toets voor continue variabelen en c 2-toets voor categorische gegevens. Nadat univariate analyse statistisch significante variabelen had gescreend, werd voorwaartse stapsgewijze meervoudige logistische regressieanalyse uitgevoerd om confounders gelijktijdig aan te passen en multivariate aangepaste odds ratio's te berekenen. Het niveau van modelselectie is vastgesteld op 0,15 voor in- en uitmodellen. P < .05 werd als statistisch significant beschouwd.