Estudio de etiología de la enfermedad de Kawasaki

Selección de pacientes y vigilancia familiar: en el Hospital Universitario Nacional de Taiwán en Taiwán, estudiaremos a los pacientes que cumplen los criterios de la enfermedad de Kawasaki o la enfermedad de Kawasaki atípica y los miembros de su familia desde 2004 hasta diciembre de 2005. Se obtendrá la aprobación de la Junta de Revisión Institucional para este estudio y se obtendrán los consentimientos informados de todos los sujetos o de sus padres. Si los pacientes del servicio de urgencias, de la consulta externa o de la sala de hospitalización presentaban síndromes clínicos sugestivos de infección por EV71, se les pedía a ellos y a los miembros de su familia que participaran en el estudio. Hisopos de garganta y recto para el aislamiento del virus, y la primera muestra de sangre. Se registraron las manifestaciones clínicas, la evolución y los resultados. Si en algún momento los pacientes sospechosos de infección mostraban síntomas clínicos, se les pedía a los otros miembros de la familia en el mismo hogar que se sometieran a un examen mediante el aislamiento del virus de frotis de garganta y recibían la primera muestra de sangre. Se utilizaron entrevistas basadas en cuestionarios para recopilar información, incluidos datos demográficos, número de dormitorios en el hogar, tiempo de contacto, patrón y presencia de signos y síntomas actuales/recientes (tos, rinorrea, dolor de garganta, erupción cutánea, fiebre, dolor abdominal y diarrea). ) y antecedentes de contacto previo con personas ajenas al hogar que tenían enfermedad clínica. Las entrevistas telefónicas de seguimiento repitieron preguntas sobre signos y síntomas a intervalos de 2, 4 y 8 semanas. Si algún miembro de la familia informó haber experimentado signos o síntomas que sugieren la enfermedad de Kawasaki durante el período de seguimiento, el miembro de la familia recibirá una evaluación clínica adicional y una investigación de laboratorio repetida para detectar la enfermedad de Kawasaki. Se obtuvo una segunda muestra de sangre de los casos de KD y de todos los miembros de la familia del hogar 4 semanas después de que se obtuvo la primera muestra de sangre. Selección de casos de control: Se seleccionará aleatoriamente un control emparejado por edad y sexo. El control serán los pacientes ingresados ​​en la misma sala que tengan otros diagnósticos (como neumonía, ITU, amigdalitis). También recibirán la prueba de detección de virus y bacterias como lo hacen los miembros del hogar.

Definiciones de enfermedad de Kawasaki y enfermedad de Kawasaki atípica:

1. Criterios para la enfermedad de Kawasaki:

   • igual o superior a cinco de los siguientes: fiebre durante más de 5 días, conjuntivitis no purulenta, erupción cutánea, induración en la palma de la mano o la planta del pie y eritema seguido de descamación, linfadenopatía del cuello, lengua de fresa o fisura/sangrado del labio
2. enfermedad de Kawasaki atípica; menos de cinco de los anteriores pero con aneurisma de la arteria coronaria.

Métodos de laboratorio

1. Aislamiento de virus y serotipificación:

   Se enviaron hisopos de garganta, hisopos rectales o muestras de heces para el aislamiento del virus. Las muestras se inocularon en cultivos de células de fibroblastos embrionarios humanos, LLC-MK2, HEp-2 y rabdomiosarcoma (RD). Cuando el efecto citopático afectaba a más del 50 % de la monocapa celular, las células se raspaban y se sometían a tinción indirecta de anticuerpos fluorescentes con anticuerpos específicos (Chemicon International Inc., Temecula, CA) o se tipificaban mediante métodos específicos según los tipos de virus sospechosos.

2. Diagnóstico molecular de virus u otros patógenos de difícil cultivo:

   1. Extracción de ARN y ARN viral: la extracción de ARN y ADN se realizará utilizando el kit de aislamiento de acuerdo con la guía del fabricante. (Kit de extracción de ARN, Qiagen). Se mezclaron 140 uL de frotis faríngeo con tampón AVL durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Luego, centrifuga la mezcla. Agregue 560 uL de alcohol al 100% al precipitado e incube durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se colocará en la columna giratoria y se centrifugará a 8000 rpm durante 1 minuto dos veces. Luego se agregarán 500uL de tampón AW1 y se centrifugará la mezcla a 80000 rpm por 1 minuto, luego se agregarán 500uL de tampón AW2 y se centrifugará a 14000 rpm por 3 minutos. Desechar la solución y centrifugar a 14000 rpm durante 2 minutos. Finalmente, se agregarán de 25 a 30 uL de tampón AVE y se centrifugarán a 8000 a 10000 rpm durante 1 minuto.
   2. Transcripción inversa: la RT se realizará con el kit de síntesis de ADNc de la primera hebra para RT-PCR (Roche). Mezcle el ARN previamente extraído con reactivos que incluyen tampón, MgCl2, dNTP, cebador Oligo-p(dT)15, inhibidor de RNasa, transcriptasa inversa, vórtice brevemente, incube la reacción a 25oC durante 10 minutos y luego a 42oC durante 60 minutos. Finalmente incubar a 99oC por 5 minutos y luego enfriar a 4oC por 5 minutos.
   3. PCR TagMan en tiempo real para enterovirus, adenovirus u otra etiología viral. Los cebadores y sondas para PCR en tiempo real de enterovirus y otros virus se encuentran en la siguiente tabla. Los cebadores y las sondas para PanEV se seleccionaron en función de las regiones altamente conservadas en la región 5' no traducida del genoma del enterovirus. Los cebadores y las sondas para EV71 se seleccionaron en función de las regiones genéticas más diversas y específicas de la región VP1 del genoma del enterovirus. Otros virus potenciales, como adenovirus u otros virus respiratorios, también se realizarán mediante PCR o RT-PCR o PCR en tiempo real siguiendo las reglas de los procedimientos anteriores.
   4. Análisis diferencial representacional seguido de clonación sustractiva
3. Cultivos bacterianos y detección de toxinas: Se obtuvieron cultivos de la faringe y el recto de pacientes con KD aguda antes del inicio de la infusión intravenosa de inmunoglobulina y de pacientes de control con el uso de un sistema Culturette de Baxter Diagnostics que contiene un hisopo de algodón. La hoja de recolección de datos primarios se completó y se mantuvo en el sitio donde se obtuvieron los especímenes. A continuación, se examinaron las placas en busca de todos los estreptococos del grupo A hemolíticos y todos los S. aureus que eran coagulasa positivos mediante la prueba del tubo. A continuación, estos aislados se seleccionaron de forma ciega para detectar la presencia de producción de superantígenos bacterianos mediante inmunodifusión con antisueros contra superantígenos estafilocócicos y estreptocócicos conocidos, como se ha descrito anteriormente. (Lee PK y Schlieveret PM).
4. Prueba serológica: Las pruebas serológicas para la detección de anticuerpos de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydiae pneumoniae, ASLO se medirán mediante kits comerciales. La neutralización de anticuerpos para enterovirus se realizará mediante el protocolo estándar de la prueba de neutralización en placas de microtitulación. El aislado de EV71 TW/2272/98 se amplificó y purificó como un antígeno para ELISA de captura m para la detección de IgM de EV71. Si se define un patógeno potencial, más adelante se realizarán más pruebas serológicas para el patógeno específico.
5. Análisis estadístico: los datos se analizaron con el paquete estadístico SAS (versión 8.2, SAS Institute, Cary, Carolina del Norte). Utilizamos la prueba t de Student para variables continuas y la prueba c 2 para datos categóricos. Después de que el análisis univariado examinara las variables estadísticamente significativas, se realizó un análisis de regresión logística múltiple por pasos hacia adelante para ajustar los factores de confusión simultáneamente y para calcular los cocientes de probabilidades ajustados multivariados. El nivel de selección de modelo se fijó en 0,15 para los modelos de entrada y salida. Se consideró estadísticamente significativa una p < 0,05.