Änderungen der adaptiven Immunantworten und Effektorzellantworten nach nasaler Allergenexposition – eine Pilotstudie

Begründung der Studie

Frühere Studien zur Dynamik der klinischen und immunologischen In-vivo-Antworten auf nasales Allergen haben sich auf bestimmte Parameter konzentriert, aber nicht die Kinetik des Zusammenspiels zwischen den verschiedenen Faktoren (d. h. allergenspezifische IgE-Spiegel, lokale IgE- und Mediatorproduktion, Basophilensensitivität, Hautsensitivität). Die Forscher schlagen daher eine randomisierte, doppelblinde, placebokontrollierte Studie vor, in der die Forscher die Patienten intranasal mit Allergenextrakten provozieren und dann sowohl die klinischen als auch die immunologischen Immunantworten über einen Zeitraum von 4 Monaten genau überwachen. Danach finden weitere 4 Besuche vor und nach der Birkensaison statt.

Die Forscher werden die Immunantworten in der unmittelbaren und späten Phase auf eine nasale Provokation mit Birkenpollenextrakt außerhalb der Pollensaison untersuchen. Die Studienteilnehmer werden zunächst an 3 aufeinanderfolgenden Tagen einer nasalen Allergenprovokation unterzogen und dann über einen Zeitraum von 1 Jahr engmaschig nachbeobachtet. Um die klinische Reaktion auf eine Allergenexposition zu beurteilen, werden die Prüfärzte den Haut-Prick-Test (SPT), den gesamten nasalen Symptom-Score (TNSS), die nasale Endoskopie und das Peak Inspiratory Nasal Flow Meter (PNIF) verwenden. Zur Beurteilung der immunologischen Reaktionen werden Proben einschließlich Blut, Nasenschleimhautproben und Nasensekreten entnommen.

Studiendesign

In dieser monozentrischen, randomisierten, placebokontrollierten, doppelblinden Studie werden insgesamt 36 (6 für eine Vorstudie) Patienten auf freiwilliger Basis in diese Studie aufgenommen und randomisiert, um eine nasale Provokation mit einer der beiden Birken zu erhalten Pollenextrakt oder Placebo. Die Randomisierung erfolgt stratifiziert nach Bet v 1-spezifischen IgE-Spiegeln, um eine gleichmäßige Verteilung in beiden Gruppen zu ermöglichen. 30 Studienteilnehmer erhalten außerhalb der Birkenpollensaison an drei aufeinanderfolgenden Tagen eine nasale Provokation mit entweder Birkenpollenextrakt oder Placebo und werden danach bis zu vier Monate lang regelmäßig nachuntersucht.

Vor der Studie mit 30 Patienten werden zunächst 6 gegen Birkenpollen allergische Probanden einem kurzen Protokoll unterzogen, um dies sicherzustellen

1. Die zur nasalen Provokation verwendete Allergenkonzentration ist ausreichend, um einen Anstieg der IgE-Antikörper auszulösen
2. Dass die Titrationen des Haut-Prick-Tests angemessen sind

3. Dass der Zeitpunkt der Einnahme von Nasensekret zur Bestimmung von Mediatoren angemessen ist.

   Sollten die Ergebnisse dieser 6 Patienten zeigen, dass entweder die nasale Allergenkonzentration, Hauttesttitrationen oder der Zeitpunkt der Nasensekretion nicht angemessen sind, wird der Ethikkommission eine Änderung vorgelegt.

   Das verkürzte Protokoll umfasst 5 Besuche:

   • kompletter Screening-Besuch
   • kompletter Besuch N1
   • Besuchen Sie N2 ohne Blutentnahme und ohne Nasenentnahme
   • Besuchen Sie N3 ohne Blutentnahme und ohne Nasenentnahme
   • kompletter Besuch N7

   Screening-Besuch

   Verfahren

   • Unterzeichnung der Einwilligungserklärung (Version 2.1. für Erststudie mit Kurzprotokoll, Version 1.8 (aktualisiert für Verlängerung) für Hauptstudie)
   • Vergabe der Screening-Nummer
   • Demografische Daten
   • Geschichte der Allergie
   • Bewertung von Ein- und Ausschlusskriterien
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn SPT erforderlich ist
   • Krankengeschichte
   • Begleitmedikation
   • Vordere Rhinoskopie
   • Standard-SPT mit kommerziellem Extrakt aus: Hasel, Esche, Grasmischung, Ambrosie, Beifuß, D. pteronyssinus, D. farina, Katzen- und Hundehaare, Alternaria, Cladosporium, Histamin und Negativkontrolle
   • Titrierter Pricktest mit handelsüblichem Birkenpollenextrakt
   • Blutentnahme (max. 60 ml heparinisiertes Blut und Serum) – Ein Teil der Blutprobe wird direkt an das Labor zur Analyse der Basophilenaktivierung, des Gesamt-IgE und des spezifischen IgE für relevante Allergene gesendet. Aus dem restlichen Blut wird RNA aufbereitet und bei -80°C gelagert und Serum wird abgetrennt und bei -20°C gelagert
   • nasale Entnahme (Nasenspülung, Schleimhautkürettenentnahme und Nasensekretentnahme)

   Besuchen Sie N0

   Anforderungen an den zeitlichen Ablauf: Besuch N0 ist zwischen 2 Wochen und 4 Tage vor Besuch N1 geplant. Dies gilt nur für Patienten, die mehr als 3 Wochen vor Besuch N1 gescreent wurden

   Verfahren:

   • Blutprobe
   • Nasenprobenentnahme (Lavage, Schleimhautkürettenentnahme und Nasensekretentnahme)
   • Titrierte SPT
   • PNIF
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuchen Sie N1

   Verfahren:

   • Neubewertung der Ein- und Ausschlusskriterien (allergenspezifische IgE-Ergebnisse)
   • Randomisierung: Den Probanden wird eine Behandlungsnummer zugewiesen
   • Baseline-Blutentnahme
   • Baseline-Nasenprobenentnahme (Lavage, Nasenschleimhautprobenahme und Nasensekretprobenahme)
   • Baseline-TNSS-Score
   • Aufzeichnung von unerwünschten Ereignissen (AE).
   • Begleitmedikation
   • PNIF an Patienten und Erklärung/Demonstration der Funktionsweise. Die Patienten erhalten ein Papiertagebuch, um die täglichen PNIF-Werte (von N1 bis N5) zu verfolgen. Diese Molkerei wird auch verwendet, um die täglichen TNSS-Scores (N4-N5) aufzuzeichnen.
   • Schwangerschaftstest
   • In. Gabe von Birkenpollenextrakt oder Placebo
   • Dokumentation der Symptome unmittelbar nach der Provokation
   • Blut, PNIF, Nasenprobenentnahme (Nasenspülung, Schleimhautkürettenprobenentnahme und Nasensekretprobenentnahme) und TNSS-Score, 20 Minuten, 40 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 20–24 Stunden nach der Verabreichung des Birkenpollenextrakts (Zeitpunkt 20–24 Stunden wird durchgeführt bei Besuch N2).
   • Nasenprobenahme, PNIF- und TNSS-Score 10 Minuten, 3 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden nach der Verabreichung des Birkenpollenextrakts
   • Titrierte SPT
   • ggf. Gabe von Notfallmedikamenten (Azelastin Nasenspray, Desloratadin 5mg)

   Besuchen Sie N2

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N2 ist am Tag nach Besuch N1 geplant

   Verfahren:

   • Blut, PNIF, Nasenprobenentnahme (Lavage, Schleimhautkürettenprobenentnahme und Probenentnahme aus Nasensekret) und TNSS-Score (Zeitpunkt 20–24 Stunden nach Verabreichung des Birkenpollenextrakts in N1).
   • AE-Aufnahme
   • Begleitmedikation
   • In. Gabe von Birkenpollenextrakt oder Placebo mit anschließender Beobachtungszeit von 2 Stunden
   • Dokumentation der Symptome unmittelbar nach der Provokation
   • ggf. Gabe von Notfallmedikamenten (Azelastin Nasenspray, Desloratadin 5mg)
   • Hinweis: Bei den ersten 6 Studienteilnehmern werden keine Nasen- und Blutproben entnommen

   Besuchen Sie N3

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N3 ist am Tag nach Besuch N2 geplant

   Verfahren:

   • Blutentnahme vor der Provokation
   • Nasenprobenentnahme vor Provokation (Lavage, Schleimhautkürettenentnahme und Nasensekretentnahme)
   • TNSS-Score vor der Provokation
   • Titrierte SPT
   • Aufzeichnung von unerwünschten Ereignissen (AE).
   • Begleitmedikation
   • In. Gabe von Birkenpollenextrakt oder Placebo
   • Dokumentation der Symptome unmittelbar nach der Provokation
   • Blut, PNIF, Nasenprobenentnahme (Lavage, Schleimhautkürettenprobenentnahme und Probenentnahme aus Nasensekret) und TNSS-Score 20 Minuten, 40 Minuten, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden, 20–24 Stunden und nach der Verabreichung des Birkenpollenextrakts (Zeitpunkt 20–24 Stunden wird durchgeführt um besuchen Sie N4).
   • Nasenprobenahme, PNIF- und TNSS-Score 10 Minuten, 3 Stunden, 5 Stunden, 6 Stunden, 7 Stunden, 8 Stunden nach der Verabreichung des Birkenpollenextrakts
   • ggf. Gabe von Notfallmedikamenten (Azelastin Nasenspray, Desloratadin 5mg)
   • Hinweis: Bei den ersten 6 Studienteilnehmern werden keine Nasen- und Blutproben entnommen

   Besuchen Sie N4

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N4 ist am Tag nach Besuch N3 geplant

   Verfahren:

   • Blut, PNIF, Nasenprobenentnahme (Lavage, Schleimhautkürettenprobenentnahme und Nasensekretprobenentnahme) und TNSS-Score 20–24 Stunden nach Verabreichung von Birkenpollenextrakt.

   Besuchen Sie N5

   Besuch N5 ist 14 ±4 Tage nach Besuch N4 geplant:

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF
   • Titrierte SPT
   • TNSS-Score
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt
   • Sammlung von Papiertagebüchern von Besuch N1 bis N5

   Besuchen Sie N6

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N6 ist 14 ± 4 Tage nach Besuch N5 geplant

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF
   • Titrierte SPT
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuchen Sie N7

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N7 ist 14 ± 4 Tage nach Besuch N6 geplant

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF
   • Titrierte SPT
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuchen Sie N8

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N8 ist 14 ± 4 Tage nach Besuch N7 geplant

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF
   • Titrierte SPT
   • Punktzahl
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuchen Sie N9

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N9 ist 14 ± 4 Tage nach Besuch N8 geplant

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF
   • Titrierte SPT
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuchen Sie N10

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N9 ist 14 ± 4 Tage nach Besuch N9 geplant

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF
   • Titrierte SPT
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuch N11 – Letzter Besuch der nasalen Provokationskomponente

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch N11 ist 28 ± 4 Tage nach Besuch N10 geplant

   Verfahren:

   • Blut für immunologische Parameter und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF
   • Titrierte SPT
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuch S1 (Verlängerung - Genehmigt von der MUW-Ethikkommission am 11. Februar 2019)

   Anforderungen an den Zeitpunkt: Besuch S1 ist 4 Wochen vor dem voraussichtlichen Beginn der Birkensaison geplant (+/- 7 Tage)

   Verfahren:

   • Pollen- und PNIF-Tagebuch aus Papier werden den Patienten erklärt und gebeten, während der Birkensaison täglich auszufüllen
   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • Titrierte SPT
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuchen Sie S2

   Anforderungen an den zeitlichen Ablauf: Besuch S2 ist 4 Wochen nach Ende der Birkensaison geplant (+/- 7 Tage)

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • Sammlung Papiertagebuch
   • PNIF beobachtet
   • Titrierte SPT
   • TNSS-Score beim Besuch
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuchen Sie S3

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch S3 ist 4 Wochen nach Besuch S2 geplant - (+/- 7 Tage)

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF beobachtet
   • Titrierte SPT
   • TNSS-Score beim Besuch
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt

   Besuchen Sie S4 und Studienende

   Anforderungen an das Timing:

   Besuch S4 ist 1 Jahr nach Beginn der gesamten Studie (1 Jahr nach Besuch N0) +/- 7 Tage geplant

   Verfahren:

   • Blut- und Nasenentnahme (Lavage, Schleimhautkürette und Nasensekretentnahme)
   • PNIF beobachtet
   • Titrierte SPT
   • TNSS-Score beim Besuch
   • AE-Aufnahme
   • Schwangerschaftstest für Frauen, wenn der letzte Test länger als einen Monat zurückliegt
   • Ende des Studiums

   Beschreibungen der Studienverfahren

   Krankengeschichte der Patienten, demographische Daten, Begleitmedikation Die Patienten werden nach ihrer Krankengeschichte einschließlich demographischer Daten und Begleitmedikation, ihren allergischen Symptomen einschließlich Intensität und Dauer und ihrer allergischen Medikationsgeschichte gefragt.

   Allergiegeschichte und TNSS-Score

   Die Patienten werden nach dem Auftreten von Niesen, Rhinorrhoe, Nasenpruritus, verstopfter Nase und Schlafqualität gefragt und bei jedem Besuch jedes Symptom bewertet und zu Hause dokumentiert. Sie werden die folgende Symptombewertungsmethode verwenden: 0 = nicht vorhanden; 1 = mild – vorhanden, aber gut verträglich; 2 = mäßig – vorhanden, das Symptom ist lästig, beeinträchtigt aber nicht die Aktivitäten des täglichen Lebens; 3 = schwer – das Symptom ist schwer zu ertragen und beeinträchtigt die Aktivitäten des täglichen Lebens (24). Zusätzlich wird das Formular mit einer visuellen Analogskala der gesamten Krankheitslast versehen.

   Vordere Rhinoskopie

   Eine anteriore Rhinoskopie wird einmal während des Screening-Besuchs durchgeführt, um anatomische Abweichungen (z. Septumdeviation) oder pathologische Veränderungen (z. Nasenpolypen). Es wird unter Verwendung eines Spekulums durchgeführt, wobei der Patient mit leicht nach hinten geneigtem Kopf sitzt.

   Peak Inspiratorischer Nasaler Durchflussmesser (PNIF)

   Die Tragbarkeit und Benutzerfreundlichkeit des PNIF bietet eine einzigartige Gelegenheit, objektive Messungen zu erhalten, während die Patienten zu Hause sind. Es wurde kürzlich auch als Studieninstrument während einer nasalen Allergenprovokation validiert.

   Verfahren:

   Bei Besuch 1 werden die Patienten in der Verwendung des PNIF-Geräts (In-Check, Inspiratory Flow Meter) geschult und erhalten eines, das sie bis N5 mit nach Hause nehmen können. Der PNIF verwendet ein Rohr mit variablem Durchmesser, das direkt in Liter pro Minute kalibriert wird, zusammen mit einem Indikatorring mit geringer Trägheit. Die Position des Rings nach einem Inspirationsmanöver zeigt den maximal erreichten Flow an. Das Gerät funktioniert, wenn ein Patient durch den Mund oder die Nase einatmet, wodurch Luft durch das Messgerät gesaugt wird und ein Cursor sich entlang der Skala bewegt, um die Einatmungsgeschwindigkeit anzuzeigen. Die erreichte Flussrate kann durch Überprüfen der Position des Cursors anhand der kalibrierten Skala notiert werden.

   PNIF in der Studiendurchführung:

   Die PNIF wird den Studienteilnehmern mit nach Hause gegeben, damit sie täglich oder wöchentlich (je nach Phase der Studie) ihren nasalen Luftstrom messen können. Sie werden auch gebeten, sie zu allen Studienbesuchen mitzubringen, damit beobachtete PNIF-Messungen durchgeführt werden können.

   Haut-Prick-Test

   4.5.1 Verfahren: Allergene werden in die Dermis des Unterarms eingeführt, indem die Haut durch einen Tropfen (20 ul) einer Allergen-enthaltenden Lösung mit einer sterilen Lanzette vorsichtig eingestochen wird, wobei zwischen jedem einzelnen Applikationspunkt mindestens 2 cm Abstand bleiben. Als Negativkontrolle wird 0,9%ige Kochsalzlösung und als Positivkontrolle Histamin verwendet. Bei zuvor sensibilisierten Personen kommt es innerhalb von 15 Minuten nach Reizung mit dem jeweiligen Allergen zu juckenden Schwellungen und Hautrötungen (Quaddel- und Flare-Reaktion). Nach 20 Minuten werden die Allergenlösungen abgewischt und die Ränder der Quaddeln mit einem Kugelschreiber nachgezeichnet. Transparentes Klebeband wird auf die Haut geklebt, um die Umrisse der Quaddel auf das Klebeband für die Aufzeichnungen zu übertragen. Die Oberfläche der Quaddeln wird mittels digitaler Planimetrie berechnet. Bei der Aufnahme werden Quaddeln mit einem Durchmesser von mindestens 3 mm als positive Reaktionen gewertet.

   Testlösungen:

   Kommerziell erhältlicher Birkenpollenextrakt und ein Panel aus Baum- und Gräserpollen, Unkraut und mehrjährigen Allergenen (Allergopharma, Wien, Österreich) werden beim Screening-Besuch verwendet und gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert. Als Kontrollen werden sterile 0,9%ige NaCl-Lösung (Negativkontrolle) und Histamin (Positivkontrolle, Allergopharma, Wien, Österreich) verwendet. Sie werden gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert.

   SPT in der Studiendurchführung:

   Screening-Besuch:

   Zur Beurteilung wird ein Standard-Haut-Prick-Test mit handelsüblichem Birkenpollenextrakt und einem Panel aus Baum- und Gräserpollen, Unkraut und mehrjährigen Allergenen (alle Allergopharma, Wien, Österreich) durchgeführt, wie er in der Routinediagnostik in der Allergieklinik der HNO-Klinik eingesetzt wird Sensibilisierungsprofil des Patienten beim Screening-Besuch.

   Screening und Visiten N0, N5 - N11, S1-S4 Ein titrierter Pricktest auf Birkenextrakt wird mit zunehmenden Verdünnungen durchgeführt (Verdünnungen werden um den Faktor 3 bis zu 1:60 000 (= 11 Verdünnungsstufen) erhöht, um festzustellen die niedrigste Konzentration, die eine Hautreaktion hervorruft. Hauttests für alle Verdünnungen werden vierfach durchgeführt. Handelsübliche Positivkontrolllösung (Histamin) und Negativkontrolle werden in Duplikaten durchgeführt.

   Sicherheitsvorkehrungen Als Sicherheitsvorkehrung werden die Patienten nach dem Test 30 Minuten lang überwacht. Alle Untersuchungen werden in der Ambulanz der HNO-Klinik durchgeführt, wo eine vollständige Notfallausstattung zur Verfügung steht.

   Blutentnahme und Messung immunologischer Parameter

   Blutproben werden beim Screening-Besuch und bei allen Studienbesuchen durch Punktion der antecubitalen Vene vor dem Hauttest entnommen. Pro Besuch werden maximal 60 ml entweder heparinisiert (z. B. für Basophilen-Sensitivitäts-Assays) oder zur Herstellung von Serum (z. B. zur Bestimmung des Gesamt- und Allergen-spezifischen Immunglobulinspiegels oder RBL-Assay) entnommen. Die Serumfläschchen werden verarbeitet und das Serum wird bei -20 °C gelagert. Das allergenspezifische IgE der Blutproben des Screening-Besuchs wird von CAP-FEIA gemessen, um die allergenspezifische RAST-Klasse der Patienten zu bestimmen. Die Messung von Gesamt-, freiem und allergenspezifischem Serum-IgE, -IgG, -IgA und -IgM erfolgt entweder durch CAP-FEIA, durch Microarray-Messung oder ELISA. Die Messung wird am Ende der Studie in allen entnommenen Serumproben durchgeführt, um die Streuung zwischen den Assays zu minimieren. Die Messung der basophilen Reaktionen auf Allergen, fMLP und Anti-IgE wird bei jedem Besuch durchgeführt. Kurz gesagt, Basophile werden 15 Minuten lang verschiedenen Konzentrationen von Anti-IgE, fMLP oder rekombinanten Allergenen ausgesetzt und dann mittels Durchflusszytometrie auf die Expression von CD 63 und CD203c untersucht. Alternativ wird die Histaminfreisetzung durch im Handel erhältliche Histaminfreisetzungskits bestimmt.

   Schwangerschaftstest

   Bei weiblichen Patienten wird eine Schwangerschaft mit einem Standardurin-Schwangerschaftstest ausgeschlossen. Der Test wird vor dem ersten Haut-Prick-Test beim Screening-Besuch und danach einmal im Monat durchgeführt.

   Sammlung von Nasenproben

   Bei allen Besuchen wird eine Nasenprobenentnahme durchgeführt. Bei jedem Besuch werden Proben mit Nasosorption FXi/PU (mit einer synthetischen Absorptionsmatrix (SAM)) oder einer 10 cm langen Plastikkürette (beide Geräte von Hunt Developments, UK) entnommen.

   Nasosorption mit FXi/PU (Hunt Developments, UK):

   Unter Sicht wird das Gerät in die Nasenhöhle eingeführt und entlang der Seitenwand gegen die untere Nasenmuschel platziert. Der Zeigefinger des Patienten wird verwendet, um auf die äußeren Seiten der Flügel- und seitlichen Nasenknorpel zu drücken, um die Vorrichtung an Ort und Stelle zu halten. Nach 1 Minute werden die Geräte entfernt und die Flüssigkeit durch Zentrifugation extrahiert. Der Überstand wird bis zur weiteren Analyse auf das Vorhandensein von allergenspezifischen und Gesamt-Ig-Spiegeln, Mediator- und Zytokinspiegeln bei -70 °C eingefroren.

   Schleimhaut-mRNA-Probenahme Es wird eine 10-cm-Nasenkürette verwendet. Unter direkter Sicht wird die Kürette gegen den mittleren unteren Teil der unteren Nasenmuschel gelegt. Die Kürette wird 2-3 Mal gegen die nach außen bewegte Schleimhautoberfläche gedrückt. Diese Bewegung wird 2-3 Mal wiederholt, um eine gute Probenentnahme zu gewährleisten. Es hat sich gezeigt, dass diese Kürette und Technik den Patienten keine wesentlichen Beschwerden bereiten und daher den Vorteil haben, dass keine Lokalanästhesie erforderlich ist. Nach der Entnahme werden die Zellen in Qiagen RLT-Puffer lysiert und für eine spätere mRNA-Analyse bei -70 °C gelagert.

   4.9 Intranasale Provokation

   Birkenpollenextrakt (Allergopharma, Wien, Österreich) wird frisch in steriler 0,9%iger Kochsalzlösung verdünnt und mit einer Dosierpumpe verabreicht. Das Allergen wird mit einer Dosierpumpe verabreicht, die 15 μl pro Sprühstoß in beide Nasenlöcher bei Besuch N1, N2, N3 abgibt. Wenn der Patient nach der Provokation an Nasen- oder Augensymptomen leidet, wird Azelastin-Nasenspray oder Desloratadin 5 mg verabreicht.

   Randomisierungsverfahren

   Bei Visite N1 der Hauptstudie werden die Patienten randomisiert einer der beiden Gruppen (Birkenpollenextrakt oder Placebo) zugeteilt. Die Randomisierung der Studienteilnehmer (Verhältnis 2:1 für Provokation versus Kontrolle) erfolgt über das Online-Randomisierungsprogramm „Randomizer“ (www.meduniwien.ac.at/randomizer), das am Institut für Medizinische Informatik, Statistik und Dokumentation der Medizinischen Fakultät betrieben wird Universität Graz, Graz, Österreich. Das 2:1-Verhältnis wird gewählt, weil die Varianz der Ig-Messungen und der abgeleiteten Mengen in der Provokationsgruppe aufgrund erwarteter größerer Gesamt-Ig-Spiegel voraussichtlich größer sein wird, siehe auch Überlegungen zur Stichprobengröße weiter unten in diesem Dokument.

   Die Randomisierung wird von einer Person durchgeführt, die nicht an der Studie beteiligt ist und keinen Kontakt zu den Patienten hat, um sicherzustellen, dass die Studie doppelblind durchgeführt wird.

   Prüfprodukte und Studienmedikation

   Birkenpollenextrakt:

   Birkenpollenextrakt (Allergopharma, Wien, Österreich) wird für die intranasale Provokation verwendet. Birkenpollenextrakt wird lyophilisiert geliefert und in steriler 0,9 %iger Natriumchloridlösung gelöst. Der Gehalt an Bet v 1 im Extrakt wird durch Immunoblotting unter Verwendung von für Bet v 1 spezifischen Antikörpersonden bestimmt. Schließlich wird der Extrakt verdünnt, so dass die Endkonzentration von Bet v 1 wie zuvor 50 μg/ml beträgt Es wurde gezeigt, dass sie bei nasaler Provokation Veränderungen der spezifischen IgE-Spiegel hervorrufen.

   Kontrolllösungen:

   Kontrolllösungen enthalten Natriumchlorid 0,9 % als Negativkontrolle für den Haut-Prick-Test und als Placebo für die intranasale Provokation. Histamin (Allergopharma, Wien, Österreich) wird als positive Kontrolle für den Haut-Prick-Test verwendet. Sie werden gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert.

   Begleitmedikation

   Allgemein:

   Alle zusätzlichen Medikamente, die von den Probanden bei Eintritt in die Studie oder zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Studie eingenommen werden, gelten als Begleitmedikation und werden in der Quelldatendatei dokumentiert. Begleitmedikationen sollten während der Studie auf ein Minimum beschränkt werden, können aber bei Bedarf verabreicht werden, wenn sie das Studienprotokoll nicht beeinträchtigen.

   Notfallmedikation:

   Obwohl anaphylaktische Ereignisse in dieser Studie sehr unwahrscheinlich sind, müssen sie immer als möglich angesehen werden. Daher steht bei anaphylaktischen Reaktionen bei SPT oder nasaler Provokation sofort ein komplettes Notfallset zur Verfügung. Wenn der Patient nach der intranasalen Provokation an Nasen- und Augensymptomen leidet, wird außerdem Azelastin-Nasenspray und/oder Desloratadin 5 mg verabreicht, um die Symptome zu lindern.

   Verbotene Begleitmedikation:

   Die Probanden müssen für die Dauer der Studie keine Medikamente einnehmen, die den Studienablauf beeinträchtigen. Die folgenden Begleitbehandlungen sind während dieser Studie nicht erlaubt:

   • Systemische oder topische Kortikosteroide
   • Andere immunsuppressive Medikamente
   • Antihistaminika oder Dinatriumcromoglycat 3 Tage vor den Besuchen
   • Systemische oder intranasale adrenerge Medikamente
   • Psychopharmakologische Medikamente
   • ACE-Hemmer oder Betablocker

   Nebenwirkungen

   Ein unerwünschtes Ereignis ist jedes Ereignis während einer klinischen Studie, einschließlich einer zwischenzeitlichen Erkrankung oder eines Unfalls, das das Wohlbefinden des Probanden beeinträchtigt; es kann sich auch um einen abnormalen Laborwert handeln. Der Begriff unerwünschtes Ereignis impliziert keinen kausalen Zusammenhang mit der Studienbehandlung.

   Alle Probanden, bei denen unerwünschte Ereignisse auftreten – unabhängig davon, ob sie in Zusammenhang mit der Anwendung des Studienmedikaments stehen oder nicht – werden überwacht, bis die Symptome abgeklungen sind und alle abnormalen Laborwerte auf den Ausgangswert zurückgekehrt sind oder bis eine zufriedenstellende Erklärung für die beobachteten Veränderungen vorliegt oder bis zum Tod , in diesem Fall wird ein vollständiger pathologischer Bericht von einem qualifizierten Pathologen vorgelegt. Alle Befunde müssen auf einer Seite „Nebenwirkung“ im Fallaufzeichnungsformular gemeldet werden.

   Alle unerwünschten Ereignisse werden wie unten beschrieben gemeldet und dokumentiert. Unerwünschte Ereignisse werden in die Kategorien „ernsthaft“ und „nicht schwerwiegend“ eingeteilt. Dies bestimmt das Verfahren, das zur Meldung/Dokumentation des unerwünschten Ereignisses verwendet werden muss.

   Definition von schwerwiegenden und nicht schwerwiegenden unerwünschten Ereignissen

   Ein schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis ist:

   • Jedes Ereignis, das tödlich oder lebensbedrohlich ist
   • Jedes Ereignis, das dauerhaft deaktiviert
   • Jedes Ereignis, das einen Krankenhausaufenthalt erfordert oder verlängert
   • Jedes Ereignis, das Krebs oder angeborene Anomalien beinhaltet oder als Folge einer Überdosierung auftritt (Anwendung von mehr als der vorgeschriebenen Dosis).

   Unerwünschte Ereignisse, die nicht in diese Kategorien fallen, werden als nicht schwerwiegend definiert.

   Einschätzung des Schweregrades von AE

   Unabhängig von der Einstufung eines unerwünschten Ereignisses als schwerwiegend oder nicht schwerwiegend (siehe oben), muss sein Schweregrad allein nach medizinischen Kriterien als leicht, mittelschwer oder schwer beurteilt werden:

   Leicht = Routinetätigkeiten nicht störend, akzeptabel Moderat = Routinetätigkeiten störend Schwer = Routinetätigkeiten nicht durchführbar, vom Arzt als inakzeptabel erachtet, Behandlung erforderlich, Studienabbruch erforderlich oder Nachwirkung.

   Es ist zu beachten, dass ein schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis nicht unbedingt schwerwiegend sein muss. Unabhängig vom Schweregrad müssen alle schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse wie folgt gemeldet werden.

   Meldung/Dokumentation unerwünschter Ereignisse

   Unerwünschte Ereignisse werden durch Spontanmeldungen erfasst.

   Meldung/Dokumentation schwerwiegender unerwünschter Ereignisse

   Alle schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse, die während dieser Studie auftreten, unabhängig davon, ob sie mit der Studienmedikation in Zusammenhang stehen oder nicht, müssen auf einer Seite „Nebenwirkung“ im Fallberichtsformular dokumentiert werden.

   Ein Folgebericht mit allen neuen Informationen zu dem schwerwiegenden Ereignis muss erstellt und eingeholt werden.

   Der Prüfer wird der Ethikkommission auf Anfrage Kopien all dieser Berichte vorlegen. Gegebenenfalls informieren die Ermittler die Behörden.

   Meldung/Dokumentation von nicht schwerwiegenden unerwünschten Ereignissen

   Diese sind in der Fallakte auf einer Seite „Nebenwirkung“ zu dokumentieren.

   statistische Analyse

   Da es sich um eine Pilotstudie handelt, gelten die durchgeführten Analysen als explorativ und hypothesengenerierend.

   Patientencharakteristika und Ergebnisvariablen werden beschrieben, indem Maximum, Minimum, Median, Mittelwert und Standardabweichung für metrische Variablen und absolute und relative Häufigkeiten für kategoriale Variablen berechnet werden.

   Um Zeitverläufe von IgE-Spiegeln und anderen Ergebnisvariablen zu analysieren, werden deskriptive Statistiken sowie 95%-Konfidenzintervalle für den Mittelwert für jeden Zeitpunkt und jede Behandlungsgruppe separat berechnet. Um heterogenen Ausgangswerten zwischen Patienten Rechnung zu tragen, werden die beobachteten Ergebnisse für jeden Patienten durch die jeweiligen Ausgangswerte für diese Analysen standardisiert. Außerdem werden für jeden Zeitpunkt mittlere Unterschiede zwischen den Gruppen und entsprechende 95%-Konfidenzintervalle berechnet. Zur grafischen Veranschaulichung werden die individuellen Trajektorien jedes Patienten geplottet.

   Die im Haut-Prick-Test beobachteten Daten bestehen aus einer Reihe von Allergendosen und den daraus resultierenden Flächenmessungen. Basierend auf vorläufigen Daten von acht Patienten in früheren Studien wurde festgestellt, dass ein exponentielles Modell des Typs Fläche = A*(1-exp(-λ Dosis) die im Haut-Prick-Test beobachtete Dosis-Wirkungs-Beziehung angemessen beschreibt. Das Modell wird für jeden Zeitpunkt in jeder Gruppe unter Verwendung eines nichtlinearen Algorithmus der kleinsten Quadrate angepasst. Aus diesen Modellen werden die Ansprechrate λ, die Plateaufläche A und die 50 % effektive Dosis zusammen mit 95 % Konfidenzintervallen angegeben.

   Wenn Werte fehlen, werden alle Analysen auf Basis verfügbarer Fälle durchgeführt.

   Überlegungen zur Stichprobengröße:

   Angesichts des explorativen Charakters der Studie basieren die Überlegungen zur Stichprobengröße auf der Genauigkeit der Parameterschätzungen. Das primäre Ziel ist die Analyse der IgE-Spiegel über die Zeit. Daten aus einer früheren Studie zeigen einen relativen Anstieg von Anti-Bet v 1 IgE vier Wochen nach nasaler Provokation mit Bet v 1 um einen mittleren Faktor von 1,4 und eine Standardabweichung von ungefähr 0,5 zwischen Patienten. Bei einem Kontrollantigen betrug der mittlere Faktor 1,04 mit einer Standardabweichung von ungefähr 0,25. Die maximale statistische Genauigkeit für einen Mittelwertvergleich zwischen den beiden Gruppen wird erreicht, wenn das Zuordnungsverhältnis proportional zum Verhältnis der Standardabweichungen ist, das auf Basis der bisherigen Daten 2:1 beträgt. Unter den oben genannten Annahmen zu Effektgrößen und Standardabweichungen ergibt eine Gesamtstichprobengröße von 30 (20:10) 95 % Konfidenzintervalle mit einer Halbwertsbreite von etwa 0,2 in jeder Gruppe. Die erwartete Halbwertsbreite eines 95-%-Konfidenzintervalls für die mittlere Differenz zwischen den Gruppen beträgt 0,28. (Ein entsprechender t-Test mit zwei Stichproben hätte eine Trennschärfe von 80 %, um eine mittlere Differenz von 0,4 bei einem Signifikanzniveau von 5 % zu erkennen). Für die Analyse des Haut-Prick-Tests deuten die vorläufigen Daten darauf hin, dass bei einer Stichprobengröße von 20 die Halbwertsbreite der 95-%-Konfidenzintervalle für die 50-%-Effektivdosis ungefähr das 0,25-fache der berücksichtigten 50-%-Effektivdosis beträgt als ausreichende Genauigkeit für diese Pilotstudie. Die grafische Darstellung finden Sie im Anhang

   Ethische und rechtliche Aspekte

   Die Studie wird in Übereinstimmung mit den lokalen gesetzlichen Anforderungen und GCP durchgeführt. Sie wird gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki (1964), einschließlich aktueller Überarbeitungen, durchgeführt.

   Einverständniserklärung des Subjekts

   Vor der Zulassung zur Studie muss der Proband der Teilnahme zugestimmt haben, nachdem ihm Art, Umfang und mögliche Folgen der klinischen Studie in für ihn verständlicher Form erläutert wurden. Das Einverständnis des Probanden muss schriftlich erfolgen. Die Unterschrift des Ermittlers bestätigt die Zustimmung des Probanden. Der Patient kann die Einwilligung auch kommentarlos jederzeit und ohne negative Folgen für seine weitere medizinische Versorgung widerrufen.

   Anerkennung/Genehmigung der Studie

   Das Studienprotokoll wird vor Studienbeginn bei der Ethikkommission der Medizinischen Universität Wien und des Allgemeinen Krankenhauses Wien (Borschkegasse 8b/E 06, 1090 Wien, Österreich) eingereicht.

   Versicherung

   Alle an dieser Studie teilnehmenden Probanden werden bei der Zürich Versicherung versichert (Zürich-Versicherungs-Aktiengesellschaft, Schwarzenbergplatz 15, 1010 Wien, Tel. +43 50 1255 1255; Versicherungsnummer: 07229622-2).

   Vertraulichkeit

   Die Namen aller Versuchspersonen werden in den Ermittlerakten geheim gehalten. Die Probanden werden während der gesamten Dokumentation und Auswertung durch die Nummer identifiziert, die ihnen während der Studie zugewiesen wurde. Die Probanden werden darauf hingewiesen, dass alle Studienergebnisse streng vertraulich aufbewahrt und behandelt werden.

   Dokumentation und Nutzung von Studienergebnissen

   Dokumentation der Studienergebnisse

   Alle während der Studie gesammelten Ergebnisse werden in einer Quelldatendatei gesammelt und später in die Fallberichtsformulare (CRFs) übertragen. Alle Eintragungen auf den Fallaufzeichnungsformularen werden leserlich in schwarzer oder blauer Tinte vorgenommen. Wenn Korrekturen an Einträgen im Fallaktenformular vorgenommen werden, werden die Wörter oder Zahlen umringt und mit einem einzelnen Strich durchzogen. Der korrekte Wert wird neben dem alten Eintrag und Datum eingetragen und die Korrektur paraphiert. Falsche Eintragungen dürfen nicht mit Korrekturflüssigkeit überdeckt oder in irgendeiner Weise unkenntlich gemacht oder unkenntlich gemacht werden. Die ausgefüllten CRFs werden vom Ermittler unterzeichnet. CRFs werden unmittelbar nach der Abschlussprüfung abgeschlossen. Die Krankenakten, auf denen das CRF basiert, werden mindestens 15 Jahre lang aufbewahrt.

   Nutzung der Studienergebnisse

   Die Ergebnisse dieser Studie werden von den Forschern in einer wissenschaftlichen Zeitschrift veröffentlicht und auf wissenschaftlichen Tagungen präsentiert. Das Manuskript wird vor der Einreichung an alle Co-Forscher verteilt.