Inhibidores de la tirosina cinasa en la leucemia mieloide crónica: eficacia y tolerabilidad. El estudio TIKlet (TIKlet)

1. Pacientes

1.1. Pacientes

Se incluirán pacientes con LMC según los siguientes criterios de inclusión: a) pacientes de ambos sexos, b) edad entre 18 y 80 años, c) tratados con imatinib o nilotinib, d) incluidos en seguimiento en las Divisiones/Unidades de Hematología involucrada en el proyecto e) capaz de dar su consentimiento informado para la participación en el ensayo, f) con un cumplimiento comprobado del tratamiento programado.

Los pacientes serán excluidos de la participación en el estudio si: a) tienen menos de 18 años o tienen más de 80 años o b) no pueden dar su consentimiento informado. La imposibilidad de asistir a las visitas de seguimiento no se considerará criterio de exclusión del estudio. En este caso, los datos recopilados se utilizarán en análisis farmacocinéticos y estadísticos sobre la base de un criterio de intención de tratar.

Deben tenerse en cuenta las siguientes condiciones:

1. se permitirá la administración concomitante de otros medicamentos, siempre que se conozca el principio activo, la dosis y el período de administración;
2. se permitirá fumar y productos a base de hierbas, pero deben informarse en el formulario de informe de caso del paciente;
3. alteraciones en las funciones hepática y renal, índice de masa corporal superior a 28, o cualquier otra alteración en los exámenes fisicoquímicos no constituyen criterios de exclusión.

1.2. Tamaño de la muestra

A efectos de este estudio se ha estimado que será necesario reclutar al menos 206 sujetos por fármaco (total, 412 pacientes), teniendo en cuenta:

1. la frecuencia del alelo menor del polimorfismo más estudiado evaluado en este protocolo de investigación (es decir, 0,3, alelo T del polimorfismo ABCB1 c.3435C>T);
2. la proporción 1:1 de portadores del alelo C y pacientes homocigóticos para el alelo T del polimorfismo ABCB1 c.3435C>T;
3. los efectos de las covariables sobre la farmacocinética del fármaco se considerarán significativos cuando la diferencia media en los parámetros farmacocinéticos sea al menos del 20 %;
4. la potencia del estudio será del 80%;

5. el error alfa se establecerá en 0.05.

   1.3. Inscripción

   La inscripción de pacientes en los distintos centros participantes será competitiva, hasta alcanzar los 206 pacientes por fármaco.

   En la primera visita, se presentará el estudio TIKlet a los pacientes que cumplan los criterios de inclusión/exclusión. Se realizarán las siguientes actividades:

   • se informará a los pacientes sobre las características, objetivos y procedimientos del estudio.
   • El consentimiento para participar en el estudio se confirmará mediante la firma del formulario de consentimiento informado.
   • Asignación de códigos alfanuméricos personales para identificación y privacidad del paciente.
   • Actualización de la lista de inscritos.
   • Recopilación de los principales datos del paciente (edad, sexo, edad al diagnóstico, resultados de las pruebas de química clínica según consta en la historia clínica del paciente y cualquier terapia combinada, con sus dosis y duración) dentro del formulario de informe de caso individual (CRF).
   • Se realizará una extracción de sangre (aproximadamente 4 ml) de una vena periférica del antebrazo. En el CRF del paciente se registrará el momento en que se realizará la extracción de sangre, junto con el tiempo transcurrido desde la última administración de imatinib o nilotinib. Para la manipulación de muestras, consulte la sección 2.1. "Manejo de muestras de sangre".
   • La lista actualizada de pacientes inscritos y los formularios de informes de casos individuales se enviarán a la División de Hematología, Departamento de Medicina Clínica y Experimental, Universidad de Pisa.

   1.4 Visitas de seguimiento

   De acuerdo con la rutina clínica de cada centro participante, en cada visita de seguimiento se deben realizar las siguientes actividades:

   • Recopilación de datos del paciente: resultados de pruebas de química clínica, análisis citogenéticos y resultados de biología molecular (niveles de transcripción BCR/Abl), cualquier terapia concomitante, cualquier reacción adversa a medicamentos.

   • Se recolectará una muestra de sangre (aproximadamente 4 ml) de una vena periférica del antebrazo. En el CRF del paciente se registrará el momento en que se realizará la extracción de sangre, junto con el tiempo transcurrido desde la toma de la última dosis de imatinib o nilotinib. Para la manipulación de muestras, consulte la sección 2.1. "Manejo de muestras de sangre".

     2. Análisis de laboratorio

   Los análisis de laboratorio se realizarán en la División de Farmacología, Departamento de Medicina Clínica y Experimental, Universidad de Pisa (medición de concentraciones plasmáticas de fármacos, análisis farmacogenéticos) y en el Departamento de Farmacología, Universidad de Bolonia (análisis farmacogenéticos).

   2.1. Manipulación de muestras de sangre

   Cada tubo que contenga sangre total, plasma o ADN del paciente (ver más abajo) y que se utilice para la realización de análisis de seguimiento terapéutico o farmacogenéticos se identificará mediante a) el código del paciente yb) la fecha de ejecución de la extracción de sangre.

   Todas las muestras de sangre se recolectarán en tubos Vacutainer® de heparina litio, luego se almacenarán a 4 °C hasta su centrifugación. La muestra se centrifugará y el plasma resultante (1,5 ml) se recogerá y almacenará en un tubo para la monitorización terapéutica de fármacos. Solo durante la visita de inscripción, se recolectará una alícuota de sangre total (0,5 ml) en un eppendorf estéril para análisis moleculares. Ambas muestras se almacenarán a -20 °C durante un máximo de 2 semanas, luego se enviarán al Departamento de Medicina Clínica y Experimental de la Universidad de Pisa.

   Para el almacenamiento de muestras, consulte la sección 2.7. "Almacenamiento de muestras biológicas".

   2.2 Medición de la concentración plasmática de fármacos

   La medición de las concentraciones plasmáticas de imatinib y su metabolito activo y nilotinib se realizará mediante un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) utilizando kits disponibles comercialmente (Chromsystems GmbH, Munich, Alemania) en instrumentos Waters Breeze y Alliance (Waters, EE. UU. ).

   Brevemente, las columnas de extracción en fase sólida se equilibrarán con los tampones de equilibrio 1 y 2, luego se agregarán el estándar interno y el plasma (0,5 ml). La columna se centrifugará y posteriormente se lavará con tampón de lavado y agua para HPLC. El eluato se recogerá por centrifugación, se diluirá con agua para HPLC y se inyectará (0,025 ml) en el sistema de HPLC para la ejecución del análisis. Se registrará el área del pico de los analitos de interés (imatinib y su metabolito activo, nilotinib y patrón interno) y se obtendrá la concentración real de fármaco en plasma por comparación con las curvas de calibración estándar para cada día de análisis.

   Los análisis de HPLC se realizarán semanalmente. Los informes de los análisis serán enviados a las Divisiones/Unidades de Hematología y registrados tanto en la historia clínica del paciente como en los CRF del estudio.

   2.3. Análisis farmacocinéticos

   Las concentraciones plasmáticas de imatinib/metabolito activo y nilotinib se analizarán a través de un análisis farmacocinético poblacional de acuerdo con un enfoque de modelado de efectos mixtos no lineal, utilizando el software NONMEM, versión 7.2. Los paquetes Xpose y PsN se utilizarán para verificar la base de datos, para el diagnóstico del modelo y las pruebas de covariables. Los modelos anteriores para imatinib/metabolito y nilotinib serán modelos de 1 y 2 compartimentos con eliminación de primer orden y parametrizados en términos de eliminación aparente del fármaco (CL/F), volumen de distribución (V/F) y constante de absorción (ka) , mientras que el error residual se modelará como error aditivo, proporcional o mixto (aditivo y proporcional). La disponibilidad de registros, gráficos de bondad de ajuste y la precisión de las estimaciones de parámetros, junto con un procedimiento de modelado aditivo generalizado (GAM) implementado en el paquete Xpose, se adoptarán para el desarrollo del modelo y para explorar las correlaciones entre las covariables. En particular, la edad, el peso, el índice de masa corporal, la función hepática (ALT, AST) y renal (concentración plasmática de creatinina), las concentraciones plasmáticas de albúmina y glucoproteína ácida α1 y los resultados de los análisis farmacogenéticos se considerarán como posibles covariables. Se realizará una construcción de modelo de covariable paso a paso con inclusión hacia adelante y exclusión hacia atrás. En particular, una disminución en el valor de la función objetivo (OFV) superior a 3,84 puntos (es decir, p<0,05) y 6,63 puntos (es decir, p<0,01) serán los criterios utilizados en los pasos de inclusión hacia adelante y exclusión hacia atrás, respectivamente. La bondad del modelo final se verificará mediante un análisis de arranque utilizando los paquetes PsN y Xpose y calculando la contracción η. El área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo desde el tiempo cero hasta el infinito (AUC) y la vida media de eliminación terminal (t1/2) se calcularán a partir de las estimaciones empíricas individuales de Bayes (EBE) del modelo farmacocinético poblacional final de la siguiente manera:

   AUC=(Dosis diaria total)/(CL/F) t1/2=ln(2)/kel donde kel es la constante de eliminación de imatinib.

   2.4. Análisis farmacogenéticos

   La alícuota de sangre entera congelada se empleará para la extracción de ADN genómico con un kit adecuado (Qiagen, Milán, Italia) siguiendo las instrucciones del fabricante y el ácido nucleico se almacenará a -80 °C hasta el momento del análisis en portatubos estéril. el código de identificación del paciente.

   Se analizarán los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) de los siguientes genes: ABCB1, ABCG2, hOCT1, OCTN1, OATP1A2. Los SNP se evaluarán con kits específicos de Applied Biosystems (Life Sciences, Milán, Italia) en un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT (Life Sciences). Cada análisis se realizará por triplicado. Los genotipos se identificarán automáticamente a través del software SDS (Life Sciences). La frecuencia de alelos y genotipos de acuerdo con la ley de Hardy-Weinberg, el análisis de desequilibrio de ligamiento y haplotipos se realizará utilizando el paquete de software Arlequin.

   2.5. Efectividad y tolerabilidad del tratamiento

   La respuesta a la terapia con imatinib se evaluará de acuerdo con los criterios publicados y adoptados recientemente. En particular, los resultados de los análisis químicos, bioquímicos y moleculares se realizarán cada 2 semanas durante los primeros 3 meses de tratamiento, luego los análisis citogenéticos (ensayo de bandas cromosómicas en metafase) y moleculares (cuantificación de los niveles de transcripción de BCR-ABL en plasma por análisis en tiempo real). -PCR) se realizaron cada 6 y 3 meses, respectivamente, hasta la consecución de una respuesta completa. El tiempo hasta la respuesta citogenética completa (CCyR) y la respuesta molecular mayor (MMR) se definirá como el tiempo transcurrido desde el diagnóstico y el logro de la respuesta para cada paciente.

   Además, las reacciones adversas asociadas al tratamiento (es decir, náuseas y vómitos, edema periorbitario, calambres y mialgia, neutropenia, toxicidad cutánea y hepática) se identificarán y calificarán de acuerdo con el sistema de calificación Common Toxicity Criteria-NCI (versión 3).

   2.6. análisis estadístico

   Los resultados se analizarán en forma agregada. Se calcularán los parámetros de dispersión (desviación estándar, rango), índices centrales (media, mediana) y distribución (es decir, prueba de Kolmogorov-Smirnov). Se aplicarán las pruebas estadísticas más adecuadas (ANOVA, test de Fisher, etc.) para investigar cualquier posible diferencia entre grupos, y el nivel de significancia se fijará en p = 0,05. La identificación de valores de corte para parámetros predictivos de eficacia/tolerabilidad (concentraciones plasmáticas, polimorfismos) se perseguirá mediante análisis ad hoc (análisis de características operativas del receptor, evaluación de valores predictivos positivos y negativos).

   2.7. Almacenamiento de muestras biológicas

   Todas las muestras biológicas [sangre total (0,5 ml), plasma (1,5 ml) y ADN genómico] se almacenarán en la División de Farmacología, Departamento de Medicina Clínica y Experimental de la Universidad de Pisa. Las alícuotas de muestras de ADN para análisis farmacogenéticos se almacenarán en el Departamento de Farmacología de la Universidad de Bolonia.

   Cada muestra estará identificada por el código alfanumérico individual asignado a cada paciente. Según protocolo, los pacientes pueden requerir la destrucción de sus propias muestras biológicas.

   2.8. Paternidad literaria

   Se adoptarán los criterios declarados por el ICMJE (International Committee of Medical Journal Editors) para la definición de autoría.