Inhibiteurs de la tyrosine kinase dans la leucémie myéloïde chronique : efficacité et tolérance. L'étude TIKlet (TIKlet)

1. Patients

1.1. Les patients

Les patients atteints de LMC seront inclus selon les critères d'inclusion suivants : a) patients des deux sexes, b) âge compris entre 18 et 80 ans, c) traités par imatinib ou nilotinib, d) inclus dans le suivi dans les Divisions/Unités de Hématologie impliquée dans le projet e) capable de donner son consentement éclairé à la participation à l'essai, f) avec une conformité prouvée au traitement prévu.

Les patients seront exclus de la participation à l'étude si : a) âge <18 ou >80 ans ou b) incapable de fournir un consentement éclairé. L'impossibilité d'assister aux visites de suivi ne sera pas considérée comme un critère d'exclusion de l'étude. Dans ce cas, les données collectées seront utilisées dans des analyses pharmacocinétiques et statistiques sur la base d'un critère d'intention de traiter.

Il convient de noter les conditions suivantes :

1. l'administration concomitante d'autres médicaments sera autorisée, à condition de connaître le principe actif, la dose et la période d'administration ;
2. les produits à fumer et à base de plantes seront autorisés, mais ils doivent être signalés sur le formulaire de rapport de cas du patient ;
3. les altérations des fonctions hépatique et rénale, un indice de masse corporelle supérieur à 28 ou toute autre altération des examens physico-chimiques ne constituent pas des critères d'exclusion.

1.2. Taille de l'échantillon

Pour les besoins de cette étude, il a été estimé qu'il faudra recruter au moins 206 sujets par médicament (total, 412 patients), en tenant compte :

1. la fréquence des allèles mineurs du polymorphisme le plus étudié évalué dans ce protocole de recherche (c'est-à-dire 0,3, allèle T du polymorphisme ABCB1 c.3435C>T);
2. les porteurs de l'allèle C au rapport 1:1 et les patients homozygotes pour l'allèle T du polymorphisme ABCB1 c.3435C>T ;
3. les effets covariables sur la pharmacocinétique des médicaments seront considérés comme significatifs lorsque la différence moyenne des paramètres pharmacocinétiques sera d'au moins 20 % ;
4. la puissance de l'étude sera de 80 % ;

5. l'erreur alpha sera fixée à 0,05.

   1.3. Inscription

   L'inscription des patients dans les différents centres participants sera compétitive, jusqu'à l'atteinte de 206 individus par médicament.

   Lors de la première visite, l'étude TIKlet sera présentée aux patients qui satisferont aux critères d'inclusion/exclusion. Les activités suivantes auront lieu :

   • les patients seront informés des caractéristiques, des objectifs et des procédures de l'étude.
   • Le consentement à la participation à l'étude sera confirmé par la signature du formulaire de consentement éclairé.
   • Attribution de code alphanumérique personnel pour l'identification et la confidentialité du patient.
   • Mise à jour de la liste des inscrits.
   • Collecte des principales données du patient (âge, sexe, âge au diagnostic, résultats des tests biochimiques tels que consignés dans le dossier du patient et éventuelles combinaisons thérapeutiques, avec leurs doses et leur durée) au sein du formulaire de rapport de cas individuel (CRF).
   • Un prélèvement sanguin (environ 4 ml) sera effectué à partir d'une veine périphérique de l'avant-bras. L'heure à laquelle le sang sera prélevé sera enregistrée dans le CRF du patient, ainsi que le temps écoulé depuis la dernière administration d'imatinib ou de nilotinib. Pour la manipulation des échantillons, voir la section 2.1. "Manipulation des échantillons de sang".
   • La liste mise à jour des patients inscrits et les formulaires de rapport de cas individuels seront envoyés à la Division d'hématologie, Département de médecine clinique et expérimentale, Université de Pise

   1.4 Visites de suivi

   Selon la routine clinique de chaque centre participant, les activités suivantes doivent être effectuées lors de chaque visite de suivi :

   • Collecte des données du patient : résultats d'examens de chimie clinique, résultats d'analyses cytogénétiques et de biologie moléculaire (niveaux de transcription BCR/Abl), toute thérapie concomitante, tout effet indésirable médicamenteux.

   • Un échantillon de sang (environ 4 ml) sera prélevé dans une veine périphérique de l'avant-bras. L'heure à laquelle le sang sera prélevé sera enregistrée dans le CRF du patient, ainsi que le temps écoulé depuis la prise de la dernière dose d'imatinib ou de nilotinib. Pour la manipulation des échantillons, voir la section 2.1. "Manipulation des échantillons de sang".

     2. Analyses de laboratoire

   Les analyses de laboratoire seront menées à la Division de pharmacologie, Département de médecine clinique et expérimentale, Université de Pise (mesure des concentrations plasmatiques de médicaments, analyses pharmacogénétiques) et au Département de pharmacologie, Université de Bologne (analyses pharmacogénétiques).

   2.1. Manipulation des échantillons de sang

   Chaque tube contenant le sang total, le plasma ou l'ADN du patient (voir ci-dessous) et utilisé pour l'exécution du suivi thérapeutique ou des analyses pharmacogénétiques sera identifié par a) le code du patient et b) la date d'exécution du prélèvement sanguin.

   Tous les échantillons de sang seront prélevés dans des tubes Vacutainer® à héparine de lithium, puis ils seront conservés à 4 °C jusqu'à centrifugation. L'échantillon sera centrifugé et le plasma résultant (1,5 ml) sera collecté et stocké dans un tube pour le suivi thérapeutique des médicaments. Uniquement lors de la visite d'inscription, une aliquote de sang total (0,5 ml) sera prélevée dans un eppendorf stérile pour analyses moléculaires. Les deux échantillons seront conservés à -20 °C pendant un maximum de 2 semaines, puis ils seront envoyés au Département de médecine clinique et expérimentale de l'Université de Pise.

   Pour le stockage des échantillons, voir la section 2.7. "Stockage d'échantillons biologiques".

   2.2 Mesure de la concentration plasmatique des médicaments

   La mesure des concentrations plasmatiques d'imatinib et de son métabolite actif, et de nilotinib sera effectuée par une méthode de chromatographie liquide à haute performance (HPLC) à l'aide de kits disponibles dans le commerce (Chromsystems GmbH, Munich, Allemagne) sur des instruments Waters Breeze et Alliance (Waters, États-Unis ).

   Brièvement, les colonnes d'extraction en phase solide seront équilibrées avec les tampons d'équilibrage 1 et 2, puis l'étalon interne et le plasma (0,5 ml) seront ajoutés. La colonne sera centrifugée, puis lavée avec du tampon de lavage et de l'eau pour HPLC. L'éluat sera recueilli par centrifugation, dilué avec de l'eau pour HPLC et injecté (0,025 ml) dans le système HPLC pour l'exécution de l'analyse. La surface du pic des analytes d'intérêt (imatinib et son métabolite actif, nilotinib et étalon interne) sera enregistrée et la concentration réelle de médicament dans le plasma sera obtenue par comparaison avec des courbes d'étalonnage standard pour chaque jour d'analyse.

   Les analyses HPLC seront effectuées sur une base hebdomadaire. Les rapports d'analyse seront transmis aux Divisions/Unités d'Hématologie et enregistrés à la fois dans le dossier médical du patient et dans les CRF de l'étude.

   2.3. Analyses pharmacocinétiques

   Les concentrations plasmatiques d'imatinib/métabolite actif et de nilotinib seront analysées par une analyse pharmacocinétique de population selon une approche de modélisation non linéaire à effets mixtes, à l'aide du logiciel NONMEM, version 7.2. Les packages Xpose et PsN seront utilisés pour vérifier la base de données, pour le diagnostic du modèle et les tests de covariables. Les anciens modèles pour l'imatinib/métabolite et le nilotinib seront des modèles à 1 et 2 compartiments avec élimination de premier ordre et paramétrés en termes de clairance apparente du médicament (CL/F), de volume de distribution (V/F) et de constante d'absorption (ka) , tandis que l'erreur résiduelle sera modélisée comme une erreur additive, proportionnelle ou mixte (additive et proportionnelle). La disponibilité des enregistrements, des graphiques de qualité d'ajustement et la précision des estimations des paramètres, ainsi qu'une procédure de modélisation additive généralisée (GAM) mise en œuvre dans le package Xpose, seront adoptées pour le développement du modèle et pour explorer les corrélations entre les covariables. En particulier, l'âge, le poids, l'indice de masse corporelle, les fonctions hépatique (ALT, AST) et rénale (concentration plasmatique de créatinine), les concentrations plasmatiques d'albumine et d'α1-glycoprotéine acide et les résultats des analyses pharmacogénétiques seront considérés comme des covariables possibles. Une construction de modèle de covariable pas à pas sera effectuée avec inclusion vers l'avant et exclusion vers l'arrière. En particulier, une diminution de la valeur de la fonction objectif (OFV) supérieure à 3,84 points (c'est-à-dire p<0,05) et 6,63 points (c'est-à-dire p<0,01) seront les critères utilisés respectivement dans les étapes d'inclusion vers l'avant et d'exclusion vers l'arrière. La qualité du modèle final sera vérifiée par une analyse bootstrap en utilisant les packages PsN et Xpose et en calculant le η-shrinkage. L'aire sous la courbe concentration plasmatique-temps du temps zéro jusqu'à l'infini (AUC) et la demi-vie d'élimination terminale (t1/2) seront calculées à partir des estimations empiriques individuelles de Bayes (EBE) du modèle pharmacocinétique final de la population comme suit :

   ASC=(dose quotidienne totale)/(CL/F) t1/2=ln(2)/kel où kel est la constante d'élimination de l'imatinib.

   2.4. Analyses pharmacogénétiques

   L'aliquote de sang total congelé sera utilisée pour l'extraction de l'ADN génomique avec un kit approprié (Qiagen, Milan, Italie) suivant les instructions du fabricant et l'acide nucléique sera stocké à -80 ° C jusqu'au moment de l'analyse dans un tube stérile portant le code d'identification du patient.

   Les polymorphismes mononucléotidiques (SNP) des gènes suivants seront analysés : ABCB1, ABCG2, hOCT1, OCTN1, OATP1A2. Les SNP seront évalués par des kits spécifiques d'Applied Biosystems (Life Sciences, Milan, Italie) sur un système de détection de séquence ABI Prism 7900HT (Life Sciences). Chaque analyse sera réalisée en triple exemplaire. Les génotypes seront automatiquement identifiés grâce au logiciel SDS (Life Sciences). La fréquence des allèles et des génotypes selon la loi de Hardy-Weinberg, l'analyse des haplotypes et des déséquilibres de liaison seront effectuées à l'aide du progiciel Arlequin.

   2.5. Efficacité et tolérance du traitement

   La réponse au traitement par l'imatinib sera évaluée en accord avec les critères récemment publiés et adoptés. En particulier, des résultats d'analyses chimiques, biochimiques et moléculaires seront réalisés toutes les 2 semaines pendant les 3 premiers mois de traitement, puis des analyses cytogénétiques (metaphase chromosomal banding assay) et moléculaires (quantification des niveaux de transcription BCR-ABL dans le plasma par temps réel -PCR) ont été réalisées tous les 6 et 3 mois, respectivement, jusqu'à l'obtention d'une réponse complète. Le temps nécessaire à la réponse cytogénétique complète (CCyR) et à la réponse moléculaire majeure (MMR) sera défini comme la durée écoulée entre le diagnostic et l'obtention de la réponse pour chaque patient.

   De plus, les effets indésirables associés au traitement (c.-à-d. nausées et vomissements, œdème périorbitaire, crampes et myalgies, neutropénie, toxicités cutanées et hépatiques) seront identifiés et notés selon le système de classification des Critères communs de toxicité-NCI (version 3).

   2.6. analyses statistiques

   Les résultats seront analysés sous forme agrégée. Le paramètre de dispersion (écart-type, plage), les indices centraux (moyenne, médiane) et la distribution (c'est-à-dire le test de Kolmogorov-Smirnov) seront calculés. Les tests statistiques les plus appropriés (ANOVA, test de Fisher, etc.) seront appliqués pour étudier toute différence éventuelle entre les groupes, et le niveau de signification sera fixé à p = 0,05. L'identification de valeurs seuils pour les paramètres prédictifs d'efficacité/tolérance (concentrations plasmatiques, polymorphismes) sera poursuivie au travers d'analyses ad hoc (analyse des caractéristiques de fonctionnement du récepteur, évaluation des valeurs prédictives positives et négatives).

   2.7. Stockage d'échantillons biologiques

   Tous les échantillons biologiques [sang total (0,5 ml), plasma (1,5 ml) et ADN génomique] seront conservés à la Division de pharmacologie, Département de médecine clinique et expérimentale, Université de Pise. Des aliquotes d'échantillons d'ADN pour les analyses pharmacogénétiques seront conservées au Département de pharmacologie de l'Université de Bologne.

   Chaque échantillon sera identifié par le code alphanumérique individuel attribué à chaque patient. Selon le protocole, les patients peuvent exiger la destruction de leurs propres échantillons biologiques.

   2.8. Paternité

   Les critères déclarés par l'ICMJE (Comité international des éditeurs de revues médicales) seront adoptés pour la définition de l'auteur.