Inibitori della tirosina chinasi nella leucemia mieloide cronica: efficacia e tollerabilità. Lo studio TIKlet (TIKlet)

1. Pazienti

1.1. Pazienti

I pazienti con LMC saranno inclusi secondo i seguenti criteri di inclusione: a) pazienti di entrambi i sessi, b) età compresa tra 18 e 80 anni, c) trattati con imatinib o nilotinib, d) inclusi nel follow-up nelle Divisioni/Unità di Ematologia coinvolta nel progetto e) in grado di dare il consenso informato alla partecipazione alla sperimentazione, f) con comprovata compliance al trattamento programmato.

I pazienti saranno esclusi dalla partecipazione allo studio se: a) età <18 o >80 anni o b) incapaci di fornire il consenso informato. L'impossibilità di partecipare alle visite di follow-up non sarà considerata un criterio di esclusione dallo studio. In questo caso, i dati raccolti saranno utilizzati in analisi farmacocinetiche e statistiche sulla base di un criterio di intenzione al trattamento.

Si devono notare le seguenti condizioni:

1. sarà consentita la somministrazione concomitante di altri farmaci, purché sia ​​noto il principio attivo, la dose ed il periodo di somministrazione;
2. il fumo ei prodotti erboristici saranno consentiti, ma dovranno essere riportati sul modulo di segnalazione del paziente;
3. alterazioni della funzionalità epatica e renale, indice di massa corporea superiore a 28 o qualsiasi altra alterazione degli esami fisico-chimici non rappresentano criteri di esclusione.

1.2. Misura di prova

Ai fini di questo studio è stato stimato che sarà necessario reclutare almeno 206 soggetti per farmaco (totale, 412 pazienti), tenendo conto:

1. la minore frequenza allelica del polimorfismo più studiato valutato in questo protocollo di ricerca (cioè, 0.3, allele T del polimorfismo ABCB1 c.3435C>T);
2. i portatori dell'allele C con rapporto 1:1 ei pazienti omozigoti per l'allele T del polimorfismo ABCB1 c.3435C>T;
3. gli effetti covariati sulla farmacocinetica del farmaco saranno considerati significativi quando la differenza media nei parametri farmacocinetici sarà almeno del 20%;
4. la potenza dello studio sarà dell'80%;

5. l'errore alfa sarà impostato a 0,05.

   1.3. Iscrizione

   L'arruolamento dei pazienti nei vari centri partecipanti sarà competitivo, fino al raggiungimento di 206 individui per farmaco.

   Alla prima visita, lo studio TIKlet sarà presentato ai pazienti che soddisferanno i criteri di inclusione/esclusione. Si svolgeranno le seguenti attività:

   • i pazienti saranno informati sulle caratteristiche, gli obiettivi e le procedure dello studio.
   • Il consenso alla partecipazione allo studio sarà confermato mediante la firma del modulo di consenso informato.
   • Assegnazione codice alfanumerico personale per l'identificazione e la privacy del paziente.
   • Aggiornamento della lista degli iscritti.
   • Raccolta dei principali dati del paziente (età, sesso, età alla diagnosi, risultati degli esami chimico-clinici riportati in cartella ed eventuali terapie combinate, con relative dosi e durata) all'interno della scheda di segnalazione del caso individuale (CRF).
   • Verrà eseguito un prelievo di sangue (circa 4 ml) da una vena periferica dell'avambraccio. L'ora in cui verrà prelevato il sangue sarà registrata all'interno della CRF del paziente, insieme al tempo trascorso dall'ultima somministrazione di imatinib o nilotinib. Per la manipolazione dei campioni vedere la sezione 2.1. "Gestione del campione di sangue".
   • L'elenco aggiornato dei pazienti arruolati e le schede di segnalazione individuale saranno inviate alla Divisione di Ematologia, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di Pisa

   1.4 Visite di controllo

   Secondo la routine clinica di ciascun centro partecipante, durante ogni visita di follow-up devono essere eseguite le seguenti attività:

   • Raccolta dei dati del paziente: risultati dei test di chimica clinica, risultati dell'analisi citogenetica e di biologia molecolare (livelli del trascritto BCR/Abl), eventuale terapia concomitante, eventuale reazione avversa al farmaco.

   • Verrà prelevato un campione di sangue (circa 4 ml) da una vena periferica dell'avambraccio. L'ora in cui verrà prelevato il sangue sarà registrata all'interno della CRF del paziente, insieme al tempo trascorso dall'assunzione dell'ultima dose di imatinib o nilotinib. Per la manipolazione dei campioni vedere la sezione 2.1. "Gestione del campione di sangue".

     2. Analisi di laboratorio

   Le analisi di laboratorio saranno condotte presso la Divisione di Farmacologia, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di Pisa (misurazione delle concentrazioni plasmatiche dei farmaci, analisi farmacogenetiche) e presso il Dipartimento di Farmacologia, Università di Bologna (analisi farmacogenetiche).

   2.1. Manipolazione del campione di sangue

   Ciascuna provetta contenente sangue intero, plasma o DNA del paziente (vedi sotto) e utilizzata per l'esecuzione di monitoraggi terapeutici o analisi farmacogenetiche sarà identificata da a) il codice del paziente eb) la data di esecuzione del prelievo di sangue.

   Tutti i campioni di sangue saranno raccolti in provette Vacutainer® con litio-eparina, quindi conservati a 4 °C fino alla centrifugazione. Il campione sarà centrifugato e il plasma risultante (1.5 mL) sarà raccolto e conservato in una provetta per il monitoraggio terapeutico del farmaco. Solo durante la visita di arruolamento, un'aliquota di sangue intero (0,5 mL) verrà raccolta in un eppendorf sterile per analisi molecolari. Entrambi i campioni saranno conservati a -20 °C per un massimo di 2 settimane, quindi saranno inviati al Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale dell'Università di Pisa.

   Per la conservazione dei campioni vedere la sezione 2.7. "Conservazione dei campioni biologici".

   2.2 Misurazione della concentrazione plasmatica dei farmaci

   La misurazione delle concentrazioni plasmatiche di imatinib e del suo metabolita attivo e nilotinib sarà condotta mediante un metodo di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando kit disponibili in commercio (Chromsystems GmbH, Monaco, Germania) su strumenti Waters Breeze e Alliance (Waters, USA ).

   In breve, le colonne di estrazione in fase solida saranno bilanciate con i tamponi di equilibrio 1 e 2, quindi verranno aggiunti lo standard interno e il plasma (0,5 mL). La colonna sarà centrifugata e successivamente lavata con tampone di lavaggio e acqua per HPLC. L'eluato sarà raccolto per centrifugazione, diluito con acqua per HPLC ed iniettato (0.025 mL) nel sistema HPLC per l'esecuzione dell'analisi. Verrà registrata l'area di picco degli analiti di interesse (imatinib e il suo metabolita attivo, nilotinib e standard interno) e si otterrà l'effettiva concentrazione di farmaco nel plasma per confronto con le curve di calibrazione standard per ogni giorno di analisi.

   Le analisi HPLC saranno effettuate su base settimanale. I referti delle analisi saranno inviati alle Divisioni/Unità di Ematologia e registrati sia nella cartella clinica del paziente che nelle CRF dello studio.

   2.3. Analisi farmacocinetiche

   Le concentrazioni plasmatiche di imatinib/metabolita attivo e nilotinib saranno analizzate attraverso un'analisi farmacocinetica di popolazione secondo un approccio di modellazione a effetti misti non lineare, utilizzando il software NONMEM, versione 7.2. I pacchetti Xpose e PsN verranno utilizzati per controllare il database, per la diagnostica del modello e il test delle covariate. I modelli precedenti per imatinib/metabolita e nilotinib saranno modelli a 1 e 2 compartimenti con eliminazione di primo ordine e parametrizzati in termini di clearance apparente del farmaco (CL/F), volume di distribuzione (V/F) e costante di assorbimento (ka) , mentre l'errore residuo sarà modellato come errore additivo, proporzionale o misto (additivo e proporzionale). La disponibilità di record, i grafici di bontà di adattamento e la precisione delle stime dei parametri, insieme a una procedura di modellazione additiva generalizzata (GAM) implementata nel pacchetto Xpose, saranno adottati per lo sviluppo del modello e per esplorare le correlazioni tra le covariate. In particolare, l'età, il peso, l'indice di massa corporea, la funzionalità epatica (ALT, AST) e renale (concentrazione plasmatica di creatinina), le concentrazioni plasmatiche di albumina e α1-glicoproteina acida ei risultati delle analisi di farmacogenetica saranno considerati come possibili covariabili. Verrà eseguita una costruzione graduale del modello di covariate con inclusione in avanti ed esclusione all'indietro. In particolare, una diminuzione del valore della funzione obiettivo (OFV) maggiore di 3,84 punti (i.e., p<0,05) e 6,63 punti (i.e., p<0,01) saranno i criteri utilizzati rispettivamente nelle fasi di inclusione in avanti e di esclusione all'indietro. La bontà del modello finale sarà verificata mediante analisi bootstrap utilizzando i pacchetti PsN e Xpose e calcolando il η-shrinkage. L'area sotto la curva concentrazione plasmatica-tempo dal tempo zero fino all'infinito (AUC) e l'emivita di eliminazione terminale (t1/2) saranno calcolate dalle singole stime empiriche di Bayes (EBE) dal modello farmacocinetico della popolazione finale come segue:

   AUC=(Dose giornaliera totale)/(CL/F) t1/2=ln(2)/kel dove kel è la costante di eliminazione di imatinib.

   2.4. Analisi farmacogenetiche

   L'aliquota di sangue intero congelato verrà impiegata per l'estrazione del DNA genomico con un apposito kit (Qiagen, Milano, Italia) seguendo le istruzioni del produttore e l'acido nucleico verrà conservato a -80°C fino al momento dell'analisi in provetta sterile recante il codice identificativo del paziente.

   Saranno analizzati i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) dei seguenti geni: ABCB1, ABCG2, hOCT1, OCTN1, OATP1A2. Gli SNP saranno valutati da kit specifici di Applied Biosystems (Life Sciences, Milano, Italia) su un sistema di rilevamento di sequenze ABI Prism 7900HT (Life Sciences). Ciascuna analisi sarà eseguita in triplice copia. I genotipi saranno identificati automaticamente attraverso il software SDS (Life Sciences). La frequenza degli alleli e dei genotipi secondo la legge di Hardy-Weinberg, l'analisi dell'aplotipo e del linkage disequilibrium saranno eseguite utilizzando il pacchetto software Arlequin.

   2.5. Efficacia e tollerabilità del trattamento

   La risposta alla terapia con imatinib sarà valutata in accordo con i criteri recentemente pubblicati e adottati. In particolare, i risultati delle analisi chimiche, biochimiche e molecolari verranno eseguiti ogni 2 settimane durante i primi 3 mesi di trattamento, quindi analisi citogenetiche (analisi del banding cromosomico della metafase) e molecolari (quantificazione dei livelli di trascrizione BCR-ABL nel plasma mediante analisi in tempo reale -PCR) sono stati eseguiti rispettivamente ogni 6 e 3 mesi fino al raggiungimento di una risposta completa. Il tempo per completare la risposta citogenetica (CCyR) e per la risposta molecolare maggiore (MMR) sarà definito come il tempo trascorso dalla diagnosi e dal raggiungimento della risposta per ogni paziente.

   Inoltre, le reazioni avverse associate al trattamento (ad es. nausea e vomito, edema periorbitale, crampi e mialgia, neutropenia, tossicità cutanea ed epatica) saranno identificate e valutate secondo il sistema di classificazione Common Toxicity Criteria-NCI (versione 3).

   2.6. analisi statistica

   I risultati saranno analizzati in forma aggregata. Verranno calcolati i parametri di dispersione (deviazione standard, range), indici centrali (media, mediana) e distribuzione (es. test di Kolmogorov-Smirnov). Verranno applicati i test statistici più appropriati (ANOVA, test di Fisher, ecc.) per indagare eventuali differenze tra i gruppi e il livello di significatività sarà fissato a p = 0,05. L'identificazione dei valori di cut-off per i parametri predittivi di efficacia/tollerabilità (concentrazioni plasmatiche, polimorfismi) sarà perseguita attraverso analisi ad hoc (analisi delle caratteristiche operative del ricevitore, valutazione dei valori predittivi positivi e negativi).

   2.7. Conservazione dei campioni biologici

   Tutti i campioni biologici [sangue intero (0.5 mL), plasma (1.5 mL) e DNA genomico] saranno conservati presso la Divisione di Farmacologia, Dipartimento di Medicina Clinica e Sperimentale, Università di Pisa. Aliquote di campioni di DNA per analisi farmacogenetiche saranno conservate presso il Dipartimento di Farmacologia dell'Università di Bologna.

   Ogni campione sarà identificato dal codice alfanumerico individuale assegnato a ciascun paziente. Secondo il protocollo, i pazienti possono richiedere la distruzione dei propri campioni biologici.

   2.8. Paternità

   Per la definizione dell'authorship verranno adottati i criteri dichiarati dall'ICMJE (International Committee of Medical Journal Editors).