Inibidores de tirosina quinase na leucemia mielóide crônica: eficácia e tolerabilidade. O Estudo TIKlet (TIKlet)

1. Pacientes

1.1. Pacientes

Os pacientes com LMC serão incluídos de acordo com os seguintes critérios de inclusão: a) pacientes de ambos os sexos, b) idade entre 18 e 80 anos, c) tratados com imatinibe ou nilotinibe, d) incluídos em acompanhamento nas Divisões/Unidades de Hematologia envolvida no projeto e) capaz de dar consentimento informado para participação no estudo, f) com cumprimento comprovado do tratamento programado.

Os pacientes serão excluídos da participação no estudo se: a) idade <18 ou >80 anos ou b) incapazes de fornecer consentimento informado. A impossibilidade de comparecer às consultas de seguimento não será considerada critério de exclusão do estudo. Nesse caso, os dados coletados serão usados ​​em análises farmacocinéticas e estatísticas com base em um critério de intenção de tratar.

As seguintes condições devem ser observadas:

1. será permitida a administração concomitante de outros medicamentos, desde que se conheça o princípio ativo, a dose e o período de administração;
2. fumar e produtos fitoterápicos serão permitidos, mas devem ser relatados no formulário de relato de caso do paciente;
3. alterações nas funções hepática e renal, índice de massa corporal maior que 28, ou qualquer outra alteração nos exames físico-químicos não representam critérios de exclusão.

1.2. Tamanho da amostra

Para efeitos deste estudo estima-se que será necessário recrutar pelo menos 206 indivíduos por medicamento (total, 412 pacientes), tendo em conta:

1. a frequência do alelo menor do polimorfismo mais estudado avaliado neste protocolo de pesquisa (ou seja, 0,3, alelo T do polimorfismo ABCB1 c.3435C>T);
2. os portadores do alelo C na proporção de 1:1 e pacientes homozigotos para o alelo T do polimorfismo ABCB1 c.3435C>T;
3. os efeitos covariáveis ​​na farmacocinética do medicamento serão considerados significativos quando a diferença média nos parâmetros farmacocinéticos for de pelo menos 20%;
4. o poder do estudo será de 80%;

5. o erro alfa será definido em 0,05.

   1.3. Inscrição

   A inscrição de pacientes nos diversos centros participantes será competitiva, até atingir 206 indivíduos por medicamento.

   Na primeira visita, o estudo TIKlet será apresentado aos pacientes que atenderão aos critérios de inclusão/exclusão. Serão realizadas as seguintes atividades:

   • os pacientes serão informados sobre as características, objetivos e procedimentos do estudo.
   • O consentimento para a participação no estudo será confirmado pela assinatura do formulário de consentimento informado.
   • Atribuição de código alfanumérico pessoal para identificação e privacidade do paciente.
   • Atualização da lista de inscritos.
   • Coleta dos principais dados do paciente (idade, sexo, idade no momento do diagnóstico, resultados de exames de química clínica relatados no prontuário do paciente e quaisquer terapias combinadas, com suas doses e duração) no formulário de relato de caso individual (CRF).
   • Será realizada uma coleta de sangue (aproximadamente 4 mL) de uma veia periférica do antebraço. O horário da coleta de sangue será registrado no CRF do paciente, juntamente com o tempo decorrido desde a última administração de imatinibe ou nilotinibe. Para manuseio de amostras, consulte a seção 2.1. "Manipulação de amostras de sangue".
   • A lista atualizada de pacientes inscritos e os formulários de relato de caso individual serão enviados à Divisão de Hematologia, Departamento de Medicina Clínica e Experimental, Universidade de Pisa

   1.4 Visitas de acompanhamento

   De acordo com a rotina clínica de cada centro participante, as seguintes atividades devem ser realizadas durante cada consulta de acompanhamento:

   • Coleta de dados do paciente: resultados de testes de química clínica, análise citogenética e resultados de biologia molecular (níveis de transcrição BCR/Abl), qualquer terapia concomitante, qualquer reação adversa a medicamentos.

   • Uma amostra de sangue (aproximadamente 4 mL) será coletada de uma veia periférica do antebraço. O horário da coleta de sangue será registrado no CRF do paciente, juntamente com o tempo decorrido desde a ingestão da última dose de imatinibe ou nilotinibe. Para manuseio de amostras, consulte a seção 2.1. "Manipulação de amostras de sangue".

     2. Análises laboratoriais

   As análises laboratoriais serão realizadas na Divisão de Farmacologia, Departamento de Medicina Clínica e Experimental, Universidade de Pisa (medição de concentrações plasmáticas de drogas, análises farmacogenéticas) e no Departamento de Farmacologia, Universidade de Bolonha (análises farmacogenéticas).

   2.1. Manipulação de amostras de sangue

   Cada tubo contendo sangue total, plasma ou DNA do paciente (ver abaixo) e utilizado para a realização de monitoramento terapêutico ou análises farmacogenéticas será identificado por a) o código do paciente eb) a data da realização da coleta de sangue.

   Todas as amostras de sangue serão coletadas em tubos Vacutainer® de lítio-heparina, a seguir serão armazenadas a 4 °C até a centrifugação. A amostra será centrifugada e o plasma resultante (1,5 mL) será coletado e armazenado em tubo para monitoramento de fármacos terapêuticos. Somente durante a visita de inscrição, uma alíquota de sangue total (0,5 mL) será coletada em um eppendorf estéril para análises moleculares. Ambas as amostras serão armazenadas a -20 °C por no máximo 2 semanas, depois serão enviadas ao Departamento de Medicina Clínica e Experimental da Universidade de Pisa.

   Para armazenamento de amostras, consulte a seção 2.7. "Armazenamento de amostras biológicas".

   2.2 Medição da concentração plasmática de drogas

   A medição das concentrações plasmáticas de imatinibe e seu metabólito ativo e nilotinibe será realizada por um método de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) usando kits disponíveis comercialmente (Chromsystems GmbH, Munique, Alemanha) em instrumentos Waters Breeze e Alliance (Waters, EUA ).

   Resumidamente, as colunas de extração em fase sólida serão balanceadas com tampões de equilíbrio 1 e 2, então o padrão interno e o plasma (0,5 mL) serão adicionados. A coluna será centrifugada e posteriormente lavada com tampão de lavagem e água para HPLC. O eluato será coletado por centrifugação, diluído em água para HPLC e injetado (0,025 mL) no sistema de HPLC para execução das análises. A área de pico dos analitos de interesse (imatinibe e seu metabólito ativo, nilotinibe e padrão interno) será registrada e a concentração real da droga no plasma será obtida por comparação com curvas de calibração padrão para cada dia de análise.

   As análises de HPLC serão realizadas semanalmente. Os relatórios das análises serão enviados para as Divisões/Unidades de Hematologia e registrados tanto no prontuário do paciente quanto nos CRFs do estudo.

   2.3. Análises farmacocinéticas

   As concentrações plasmáticas de imatinib/metabólito ativo e nilotinib serão analisadas através de uma análise farmacocinética populacional de acordo com uma abordagem de modelagem não linear de efeitos mistos, usando o software NONNEM, versão 7.2. Os pacotes Xpose e PsN serão usados ​​para verificar o banco de dados, para diagnóstico do modelo e teste de covariáveis. Modelos anteriores para imatinibe/metabólito e nilotinibe serão modelos de 1 e 2 compartimentos com eliminação de primeira ordem e parametrizados em termos de depuração aparente da droga (CL/F), volume de distribuição (V/F) e constante de absorção (ka) , enquanto o erro residual será modelado como erro aditivo, proporcional ou misto (aditivo e proporcional). A disponibilidade de registros, gráficos de qualidade de ajuste e a precisão das estimativas de parâmetros, juntamente com um procedimento de modelagem aditiva generalizada (GAM) implementado no pacote Xpose, serão adotados para o desenvolvimento do modelo e para explorar as correlações entre as covariáveis. Em particular, idade, peso, índice de massa corporal, função hepática (ALT, AST) e renal (concentração plasmática de creatinina), concentrações plasmáticas de albumina e glicoproteína ácida α1 e resultados de análises farmacogenéticas serão consideradas como possíveis covariáveis. Uma construção de modelo de covariável passo a passo será realizada com inclusão para frente e exclusão para trás. Em particular, uma diminuição no valor da função objetivo (OFV) maior que 3,84 pontos (ou seja, p<0,05) e 6,63 pontos (ou seja, p<0,01) será o critério usado nas etapas de inclusão para frente e exclusão para trás, respectivamente. A qualidade do modelo final será verificada por análise bootstrap usando os pacotes PsN e Xpose e calculando η-shrinkage. A área sob a curva de concentração plasmática-tempo do tempo zero até o infinito (AUC) e a meia-vida de eliminação terminal (t1/2) será calculada a partir das estimativas Bayes empíricas individuais (EBE) do modelo farmacocinético populacional final como segue:

   AUC=(Dose diária total)/(CL/F) t1/2=ln(2)/kel onde kel é a constante de eliminação do imatinib.

   2.4. Análises farmacogenéticas

   A alíquota de sangue total congelado será empregada para a extração do DNA genômico com kit adequado (Qiagen, Milão, Itália) seguindo as instruções do fabricante e o ácido nucléico será armazenado a -80°C até o momento da análise em tubo estéril contendo o código de identificação do paciente.

   Serão analisados ​​polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) dos seguintes genes: ABCB1, ABCG2, hOCT1, OCTN1, OATP1A2. Os SNPs serão avaliados por kits específicos da Applied Biosystems (Life Sciences, Milão, Itália) em um ABI Prism 7900HT Sequence Detection System (Life Sciences). Cada análise será realizada em triplicata. Os genótipos serão identificados automaticamente através do software SDS (Life Sciences). Freqüência de alelos e genótipos de acordo com a lei de Hardy-Weinberg, análises de haplótipos e desequilíbrio de ligação serão realizadas usando o pacote de software Arlequin.

   2.5. Eficácia e tolerabilidade do tratamento

   A resposta à terapia com imatinibe será avaliada de acordo com critérios recentemente publicados e adotados. Em particular, os resultados das análises químicas, bioquímicas e moleculares serão realizados a cada 2 semanas durante os primeiros 3 meses de tratamento, depois análises citogenéticas (ensaio de bandas cromossômicas em metáfase) e moleculares (quantificação dos níveis de transcrição de BCR-ABL no plasma por tempo real -PCR) foram realizadas a cada 6 e 3 meses, respectivamente, até a obtenção de uma resposta completa. O tempo para completar a resposta citogenética (CCyR) e para a resposta molecular principal (MMR) será definido como o tempo decorrido desde o diagnóstico e obtenção da resposta para cada paciente.

   Além disso, as reações adversas associadas ao tratamento (ou seja, náuseas e vômitos, edema periorbital, cãibras e mialgia, neutropenia, toxicidade cutânea e hepática) serão identificadas e pontuadas de acordo com o sistema de classificação Common Toxicity Criteria-NCI (versão 3).

   2.6. Análise estatística

   Os resultados serão analisados ​​de forma agregada. Parâmetros de dispersão (desvio padrão, intervalo), índices centrais (média, mediana) e distribuição (isto é, teste de Kolmogorov-Smirnov) serão calculados. Os testes estatísticos mais adequados (ANOVA, teste de Fisher, etc.) serão aplicados para investigar qualquer possível diferença entre os grupos, e o nível de significância será estabelecido em p = 0,05. A identificação de valores de corte para parâmetros preditivos de eficácia/tolerabilidade (concentrações plasmáticas, polimorfismos) será realizada através de análises ad hoc (análise das características operacionais do receptor, avaliação de valores preditivos positivos e negativos).

   2.7. Armazenamento de amostras biológicas

   Todas as amostras biológicas [sangue total (0,5 mL), plasma (1,5 mL) e DNA genômico] serão armazenadas na Divisão de Farmacologia do Departamento de Medicina Clínica e Experimental da Universidade de Pisa. Alíquotas de amostras de DNA para análises farmacogenéticas serão armazenadas no Departamento de Farmacologia da Universidade de Bolonha.

   Cada amostra será identificada pelo código alfanumérico individual atribuído a cada paciente. De acordo com o protocolo, os pacientes podem exigir a destruição de suas próprias amostras biológicas.

   2.8. Autoria

   Para definição de autoria serão adotados os critérios declarados pelo ICMJE (Comitê Internacional de Editores de Revistas Médicas).