Búsqueda de células olfativas dentro del epitelio etmoidal fetal (COEF)

Este proyecto de investigación se basa en la hipótesis de que el epitelio olfatorio está presente dentro de la mucosa de las masas etmoidales laterales, similar a las fisuras olfatorias al inicio del período de organogénesis fetal, desapareciendo gradualmente antes del final del primer trimestre en las masas etmoidales laterales. a medida que se forman.

Este estudio pretende ser descriptivo, con el objetivo de identificar este epitelio olfatorio fetal y evaluar los cambios en su distribución dentro de la mucosa etmoidal a medida que avanza la edad fetal.

El método elegido para realizar este estudio se basa en el análisis histológico utilizando un microscopio óptico estándar de etmoides fetales (cuerpos enteros o solo la extremidad cefálica dependiendo del tamaño de la muestra) para preservar su arquitectura. El análisis microscópico se combinará con técnicas de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia para caracterizar las células de interés: las neuronas olfativas primarias.

La recolección de muestras será prospectiva y el reclutamiento de fetos se distribuirá a lo largo del estudio, abarcando de 18 a 24 meses. El tamaño mínimo previsto de la muestra es de 20 casos. Se prevén análisis intermedios en caso de no aportación de muestras o si hay un número suficiente de muestras para cumplir los objetivos primarios y secundarios.

Las muestras son productos fetales obtenidos de procedimientos de aborto inducido ya sea médico o quirúrgico, con una edad gestacional de mínimo 7 semanas de amenorrea y hasta 14 semanas + 6 días.

Está previsto que el reclutamiento de muestras se lleve a cabo dentro del Servicio de Ortogenia del Hospital Universitario de Maternidad de Nancy, integrado en los protocolos de servicio existentes (abortos médicos o quirúrgicos), y después de información clara y justa y la obtención del consentimiento informado por escrito de los pacientes por parte de los investigadores. Se informa a los equipos sanitarios pertinentes de las investigaciones en curso. Se debe minimizar al máximo el impacto de la investigación en la atención al paciente para evitar alterar el proceso del paciente y el procedimiento médico que se lleva a cabo. Este protocolo o, si es necesario, los investigadores in situ no deben modificar ni alterar ningún protocolo de tratamiento.

De acuerdo con la actualización de 2021 de las Recomendaciones de buenas prácticas proporcionadas por la Autoridad Nacional de Salud (HAS) de Francia y validadas por el Colegio Nacional de Ginecología y Obstetricia de Francia (CNGOF), todo procedimiento de aborto incluye una consulta médica previa realizada dentro de los 5 días siguientes la petición de una mujer. Esta consulta precede al procedimiento unos días y tiene como objetivo proporcionar información sobre el procedimiento en sí a los pacientes y abordar los requisitos médicos clínicos y paraclínicos necesarios para su ejecución exitosa. Durante este tiempo, los investigadores no intervienen para respetar la correcta ejecución del procedimiento médico, lo que requiere un período de información crucial durante el cual es preferible evitar interferencias.

Está previsto que la información al paciente sobre la investigación realizada y la obtención del consentimiento por escrito se produzca en el momento del ingreso de los pacientes a la Unidad Ambulatoria de Ginecología y Obstetricia. Esta fase, en forma de breve entrevista oral tras su ingreso por parte de los equipos médicos y paramédicos, es responsabilidad de los investigadores. Está documentado en un documento en papel que cumple con las directivas establecidas legalmente, elaborado por duplicado, conservando una copia los investigadores del DRCI (Departamento de Investigación e Innovación Clínica) y la segunda, el paciente.

Los investigadores registran la fecha del último período menstrual después de la entrevista. Estos son los únicos datos personales o médicos recopilados de pacientes hospitalizados. Una vez finalizado el procedimiento (médico o quirúrgico) según el protocolo médico establecido por los practicantes del Servicio de Ortogenia, los productos de expulsión o aspiración son recolectados e inmediatamente colocados en un recipiente de recolección biopatológico sellado mientras aún estén frescos.

Cada muestra está marcada con un número de inclusión: COEF#N° y la edad gestacional en semanas calculada a partir de la fecha del último período menstrual. Estos datos se indexan sistemáticamente en una hoja de cálculo Excel® en una computadora segura en el establecimiento hospitalario. Los investigadores transportan rápidamente la muestra al Laboratorio de Patología Fetal del Hospital Universitario de Maternidad de Nancy para congelarla rápidamente a -80 °C. Se realiza un examen preliminar de los productos bajo un microscopio binocular para aislar el material fetal de interés: cuerpos enteros, extremidades cefálicas completas o fragmentadas, incluida la masa facial intacta.

Se prevé estandarizar el acondicionamiento de cada muestra. Tras el reclutamiento de 10 casos, las muestras congeladas se someten a un procedimiento de criosección mediante un microtomo Cryocut® específico. Este paso permite la creación de secciones seriadas con un espesor de aproximadamente 5 micrómetros, montadas sobre portaobjetos de vidrio. Una fase inicial de examen extemporáneo con tinción estándar de HES permite la identificación precisa del bloqueo etmoidal y posteriormente la creación de una serie de secciones coronales. En esta etapa del desarrollo las estructuras esqueléticas no están osificadas, evitando una fase de descalcificación. Cada portaobjetos producido está marcado con un "Número de Investigación", asignado por computadora y otorgado automáticamente por el software de análisis histológico utilizado por el Laboratorio: Ariane SX®. Estos números también están indexados electrónicamente en relación con los datos de la muestra (COEF#N° y edad gestacional).

Las series de portaobjetos así creadas se tratan con técnicas de inmunohistoquímica o inmunofluorescencia.

Los marcadores inmunohistológicos planificados incluyen: sinaptofisina (SP), enolasa neuroespecífica (NSE), molécula de adhesión de células neuronales (NCAM) y factor de transcripción de oligodendrocitos (OLIG2). Estos marcadores son anticuerpos monoclonales conocidos a los que se hace referencia en la literatura para identificar neuronas olfativas primarias maduras e inmaduras.

Después de etiquetar las diapositivas, se pasan por un escáner fotográfico para generar un archivo digital que contiene todas las imágenes obtenidas de cada muestra. Cada archivo se titula según el número de indexación de cada muestra: COEF#N°. Los archivos de imágenes grabadas llevan el número de diapositiva correspondiente " Investigación ".

Dado el carácter puramente descriptivo de este estudio, se prevé realizar estadística descriptiva.

Después del análisis, cada serie de portaobjetos se almacena físicamente a 4°C en el Laboratorio de Patología Fetal bajo la responsabilidad de los investigadores. Al final del estudio, estas diapositivas se agruparán para su preservación dentro de una colección dedicada en el Centro de Recursos Biológicos de Lorraine.