Pesquisa por células olfativas no epitélio etmoidal fetal (COEF)

Este projeto de pesquisa baseia-se na hipótese de que o epitélio olfatório está presente na mucosa das massas etmoidais laterais, semelhante às fissuras olfatórias no início do período de organogênese fetal, desaparecendo gradativamente antes do final do primeiro trimestre nas massas etmoidais laterais. à medida que se formam.

Este estudo pretende ser descritivo, com o objetivo de identificar esse epitélio olfatório fetal e avaliar as alterações de sua distribuição na mucosa etmoidal à medida que a idade fetal avança.

O método escolhido para a realização deste estudo baseia-se na análise histológica utilizando um microscópio óptico padrão de etmoides fetais (corpos inteiros ou apenas a extremidade cefálica dependendo do tamanho da amostra) para preservar sua arquitetura. A análise microscópica será acoplada a técnicas de imunohistoquímica ou imunofluorescência para caracterizar as células de interesse: neurônios olfatórios primários.

A coleta de amostras será prospectiva, com recrutamento de fetos distribuídos ao longo do estudo, abrangendo 18 a 24 meses. O tamanho mínimo previsto da amostra é de 20 casos. Análises intermediárias são planejadas em caso de não contribuição de amostras ou se houver número suficiente de amostras para atender aos objetivos primários e secundários.

As amostras são produtos fetais obtidos de procedimentos de aborto induzido médico ou cirúrgico, com idade gestacional mínima de 7 semanas de amenorreia e até 14 semanas + 6 dias.

O recrutamento da amostra está planejado para ocorrer dentro do Serviço de Ortogenia do Hospital Universitário Maternidade de Nancy, integrado aos protocolos de serviço existentes (abortos médicos ou cirúrgicos), e após informações claras e justas e obtenção de consentimento informado por escrito dos pacientes pelos investigadores. As equipes de saúde relevantes são informadas sobre as pesquisas em andamento. O impacto da pesquisa no atendimento ao paciente deve ser minimizado tanto quanto possível para evitar a interrupção do processo do paciente e do procedimento médico realizado. Nenhum protocolo de tratamento deve ser modificado ou perturbado por este protocolo ou, se necessário, pelos investigadores no local.

De acordo com a atualização de 2021 das Recomendações de Boas Práticas fornecidas pela Autoridade Nacional Francesa de Saúde (HAS) e validadas pelo Colégio Nacional Francês de Ginecologia e Obstetrícia (CNGOF), todo procedimento de aborto inclui uma consulta médica prévia realizada dentro de 5 dias após pedido de uma mulher. Esta consulta antecede o procedimento em alguns dias e tem como objetivo fornecer aos pacientes informações sobre o procedimento em si e abordar os pré-requisitos médicos clínicos e paraclínicos necessários para a sua execução com sucesso. Durante este tempo, não há intervenção dos investigadores para respeitar a boa execução do procedimento médico, o que requer um período de informação crucial durante o qual é preferível evitar interferências.

As informações dos pacientes sobre a pesquisa realizada e a obtenção do consentimento por escrito estão previstas para ocorrer no momento da admissão dos pacientes no Ambulatório de Ginecologia e Obstetrícia. Esta fase, sob a forma de breve entrevista oral após a sua admissão pelas equipas médica e paramédica, é da responsabilidade dos investigadores. É documentado em documento em papel que atende às diretrizes do estabelecimento legal, produzido em duas vias, sendo uma via retida pelos investigadores para o DRCI (Departamento de Pesquisa Clínica e Inovação) e a segunda retida pelo paciente.

A data da última menstruação é registrada pelos investigadores após a entrevista. Estes são os únicos dados pessoais ou médicos coletados de pacientes hospitalizados. Concluído o procedimento (médico ou cirúrgico) de acordo com o protocolo médico estabelecido pelos profissionais do Serviço de Ortogenia, os produtos de expulsão ou aspiração são coletados e imediatamente colocados em recipiente de coleta biopatológica lacrado, ainda frescos.

Cada amostra é marcada com um número de inclusão: COEF#N° e a idade gestacional em semanas calculada a partir da data da última menstruação. Esses dados são sistematicamente indexados em planilha Excel® em computador seguro do estabelecimento hospitalar. A amostra é prontamente transportada pelos investigadores para o Laboratório de Patologia Fetal da Maternidade do Hospital Universitário de Nancy para congelamento rápido a -80°C. Um exame preliminar dos produtos ao microscópio binocular é realizado para isolar o material fetal de interesse: corpos inteiros, extremidades cefálicas completas ou fragmentadas, incluindo a massa facial intacta.

O condicionamento de cada amostra está planejado para ser padronizado. Após o recrutamento de 10 casos, as amostras congeladas são submetidas a um procedimento de criosecção utilizando um micrótomo Cryocut® específico. Esta etapa permite a criação de cortes seriados com espessura de aproximadamente 5 micrômetros, montados em lâminas de vidro. Uma fase inicial de exame extemporâneo com coloração HES padrão permite a identificação precisa do bloco etmoidal e subsequentemente a criação de uma série de cortes coronais. Nesta fase de desenvolvimento, as estruturas esqueléticas não estão ossificadas, evitando uma fase de descalcificação. Cada lâmina produzida é marcada com um “Número de Pesquisa”, atribuído por computador e fornecido automaticamente pelo software de análise histológica utilizado pelo Laboratório: Ariane SX®. Esses números também são indexados eletronicamente em relação aos dados da amostra (COEF#N° e idade gestacional).

As séries de lâminas assim criadas são tratadas com técnicas de imunohistoquímica ou imunofluorescência.

Os marcadores imuno-histológicos planejados incluem: Sinaptofisina (SP), Enolase Neuroespecífica (NSE), Molécula de Adesão Celular Neuronal (NCAM) e Fator de Transcrição de Oligodendrócitos (OLIG2). Esses marcadores são anticorpos monoclonais conhecidos e referenciados na literatura para identificar neurônios olfativos primários maduros e imaturos.

Após a etiquetagem das lâminas, elas passam por um scanner fotográfico para gerar um arquivo digital contendo todas as imagens obtidas para cada amostra. Cada arquivo é intitulado de acordo com o número de indexação de cada amostra: COEF#N°. Os arquivos de imagem gravados possuem o número "Pesquisa" do slide correspondente.

Dada a natureza puramente descritiva deste estudo, estão previstas estatísticas descritivas.

Após análise, cada série de lâminas é armazenada fisicamente a 4°C no Laboratório de Patologia Fetal sob responsabilidade dos investigadores. Ao final do estudo, essas lâminas serão agrupadas para preservação em uma coleção dedicada no Centro de Recursos Biológicos de Lorraine.