Chilen mahasyövän työryhmä (FORCE 1) (FORCE-1)

Osallistuvat tahot: Chilen mahasyövän työryhmä (GCTF) on kahden keskeisen identiteetin yhteinen ponnistus: 1- Tarkkuuslääketieteen huippuyksikkö (CEMP), joka perustettiin valtion talouskehitysviraston (Corporacion) yhteisrahoituksella. de Fomento de la Produccion, CORFO) ja Pfizer Chile sekä 2- The Center UC for Investigation in Oncology (CITO), joka sijaitsee Pontificia Universidad Católica de Chilessä. Molemmat yhteisöt ovat voittoa tavoittelemattomia tutkimusorganisaatioita, joiden tavoitteena on edistää julkista koulutusta ja toteuttaa strategioita kliinisten tulosten parantamiseksi onkologian hoidossa ja syövän ehkäisyssä.

Ensisijainen tavoite: Jakaa Chilen GC-potilaat prognostisiin alaryhmiin ja korreloida hoitovastetta kliinisten, proteiinien, epigeneettisten ja geneettisten muutosten mukaan 200 GAC-potilaan kohortissa.

Toissijaiset tavoitteet

• Mutaatioprofiilin määrittäminen Chilen GC-potilailla.
• Arvioida niiden Chilen GC-potilaiden prosenttiosuus, jotka voisivat hyötyä tällä hetkellä saatavilla olevista lääkeainekohteista (toimivia geenejä).
• Korreloida EBV:n esiintyminen kliinisiin parametreihin.
• Arvioida proteiinien ilmentymistasoja, jotka liittyvät molekyylien kerrostumiseen ja tällä hetkellä kohdennettuihin hoitoihin (esim. PD-L1 ja antiangiogeeniset aineet)
• Selvittää SNP:iden profiili DPYD- ja TYMS-geeneissä Chilen GC-potilailla ja niiden korrelaatio haittatapahtumien kanssa.

Opintojen suunnittelu

Eettinen hyväksyntä GCTF on ei-interventio, yhteistyöhön perustuva prospektiivinen ei-samaaikainen tutkimus, jonka tarkoituksena on jakaa GAC-potilaat heidän ennusteensa ja hoitovasteensa perusteella. Tutkimuksessa noudatetaan tiukasti kaikkia kansainvälisten järjestöjen asettamia lakisääteisiä vaatimuksia, määräyksiä ja yleisiä periaatteita, jotka ohjaavat ihmisten biolääketieteellisen tutkimuksen eettistä toimintaa hyvien kliinisten käytäntöjen ja Helsingin julistuksen mukaisesti. GCTF-tutkimusprotokolla on hyväksynyt yliopistosairaalan eettinen komitea (Pontificia Universidad Catolica de Chile, CEC MED UC hyväksyntänumero 16-046, päätös päivätty 21. huhtikuuta 2016).

Potilaiden rekrytointi ja ominaisuudet Diagnosoidut GC-potilaat rekrytoidaan Red UC Christus -verkostosta Santiagossa, Chilessä. CITO hoitaa potilaiden rekrytoinnin ja tietoon perustuvien suostumuslomakkeiden allekirjoittamisen, potilastietojen ylläpidon ja seurannan, biologisen materiaalin ja näytteiden ottamisen.

Potilas- ja hoitohistoria paljastaa, että leikkauksen ja kemoterapian lisäksi noin 10 % potilaista sai trastutsumabia (ERBB2-kohdennettu hoito, jota kutsutaan myös Herceptiniksi), ja toiset 10 % sai immunoterapiaa, mukaan lukien pembrolitsumabi ja ipilimumabi (tarkistuspisteen estäjät). Lopulta noin 5 % potilaista sai antiangiogeenistä hoitoa (johon sisältyi VEGFR2-kohdennettu hoito ramusirumabilla). Lisäksi histologinen analyysi osoitti, että noin 50 % potilaista luokiteltiin suolistotyyppisiksi, 30 % diffuusiksi ja 20 % oli joko sekalaisia ​​tai määrittelemättömiä.

Sisällyttämiskriteerit

• Aikuinen mies tai nainen, yli 18-vuotias
• Diagnosoitu mahasyöpä (histologinen tai sytologinen)
• Osallistuminen Red UC Christus -verkoston terveyskeskuksiin vähintään 3 kuukauden ajan kliinisen seurannan kanssa
• Pystyy lukemaan ja puhumaan espanjaa
• Halukas ja kykenevä antamaan kirjallinen tietoinen suostumus tutkimukseen, joka tulee päivätä ja allekirjoittaa ilmoittautumisen yhteydessä.

Poissulkemiskriteerit

Potilaat:

• Pienet biopsianäytteet eivät riitä analyysiin.
• joiden potilastietoja ei voida kerätä tai ne eivät ole saatavilla.
• Ilman allekirjoitettua tietoista suostumusta.

Kliiniset tiedot Terveydenhuollon tarjoajat hankkivat potilaiden kliiniset tiedot ja syöttävät ne sähköiseen verkkoalustaan. Näytteet koodataan ja potilaan henkilöllisyys on vain hoitavan lääkärin tiedossa. Kliiniset muuttujat on jaettu osiin: Yleiset potilastiedot, Syöpähistoria, Laboratoriotutkimukset, Komorbiditeetti (Charlson) -indeksi, Kemoterapia, Tehokkuus ja seuranta ja Toksisuus. Potilaan kemoterapia luokitellaan seuraavien mukaan: hoito-ohjelma, jaksojen lukumäärä ja hoitoaika sekä kemoterapian annosintensiteetti ensimmäisten 6 kuukauden aikana. Kemoterapia-ohjelmat, jotka edustavat potilaille määrättyä ensimmäisen linjan kemoterapiaa. Täysi kemoterapian annosintensiteetti ensimmäisten 6 kuukauden aikana saadaan potilashaastatteluilla ja syötetään suoraan online-alustalle. Lopuksi potilailta saadut teho-, seuranta- ja toksisuustiedot.

Tärkeimmät kliiniset tulokset Tärkeimmät tulokset päätellään saaduista kliinisistä tiedoista, joita ovat kokonaiseloonjääminen, etenemisvapaa ja uusiutumaton eloonjäämisaste.

Biologiset näytteet & Oncomine Comprehensive Assay Red UC Christusista saadut biologiset materiaalit kuljetetaan CEMP:hen Santiago de Chileen standardoitujen protokollien mukaisesti. Yhteensä 200 potilaan kasvainnäytettä otetaan arkistoiduista Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE) -näytteistä. Nukleiinihapot uutetaan käyttämällä RecoverAll-pakkausta (Thermo Fisher Cat #AM1975) ja analysoidaan käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevaa Oncomine Comprehensive Assay -määrityspakkausta. Tämä määritys analysoi samanaikaisesti näytteistä peräisin olevan DNA:n ja RNA:n, mikä mahdollistaa 73 geenin hotspotin (DNA:n perusteella), 49 fokaalisen kopiomäärän muunnelman (CNV:t, DNA-pohjainen), 26 täydellisen koodaavan sekvenssin (mutaatioiden ja CNV-häviön varalta) ja 22 geenifuusion arvioinnin. ajurit (RNA). Erityisesti 72 näistä geeneistä on lääkekohteita. Saatu genominen raakadata (.vcf ja .pdf tiedostot) tallennetaan ja varmuuskopioidaan paikalliseen tietokeskukseen myöhempää genomianalyysiä varten. Kun tämän tutkimuksen tulokset julkaistaan, Oncomine-tulokset sekä yksittäisten kasvainten kliininen luokittelu asetetaan julkisesti saataville.

Tissue Micro Array (TMA) -analyysi Seuraavat geenit analysoidaan edelleen TMA:lla käyttämällä spesifisiä vasta-aineita: PD-L1 (Dako, luettelonumero SK00521), PD-L2 (Thermo Cat# B7-DC/CD273), fosforyloitu mTOR ( Abcam Cat#AB118815), p53 (Cat # 5278074001), VEGFR2 (Abcam Cat #AB39256), fosforyloitu Akt (Thermo Cat # 473), HER2 (Roche, Cat # 05278368001), p16 (Roche, Cat # 1), Met 0 2 Abcam Cat #AB51067), HA-4 (Abcam Cat #AB24480) ja neljä mikrosatelliittimerkkiä (kaikki Rochelta): MLH1 (Cat # 06472966001), MSH2 (Cat # 05269270001), MSH6 (Cat # 5929), # 1 1MS (Cat) 06419216001). Manuaalinen TMA valmistetaan edellä kuvatulla tavalla. Lyhyesti sanottuna parafiinilohkot hankitaan ja leikataan ja värjätään Hematoxylin & Eosinilla (H&E) parhaan histologisen alueen valitsemiseksi. Myöhemmin valittu kudosalue sijoitetaan TMA:han kiertämällä tunnistettu alue vastaavassa lohkossa. Jokaisesta parafiinilohkosta otetaan sylinterimäiset ydinbiopsiat 1 mm:n mandriinilla ja sijoitetaan uuteen vastaanottajalohkoon. Valituissa sopivissa tapauksissa oli kasvaimia, jotka valtasivat vähintään 10 % ydinalueesta. Jokainen tapaus käsitellään kolmena kappaleena kudosten menettämisen estämiseksi leikkauksen aikana. Jokaisesta kudosryhmälohkosta leikataan leikkeet, niistä poistetaan parafiini ja ne kuivataan H&E- ja immunohistokemiallisia toimenpiteitä varten.

Geenimetylaatio Arvioidaan promoottorigeenin metylaatio kuudella valitulla geenillä, jotka ovat aiemmin osoittaneet promoottorisäätelyä metylaatiolla, joka liittyy GC:hen. Metylaatioanalyysi sisältää reprimo-geenin ja muut GC:n etenemiseen liittyvät mRNA:t. Analyysi suoritetaan bisulfiittisekvensoinnilla, kuten aiemmin on kuvattu, käyttäen EZ DNA Metylation Gold -pakkausta (Zymo Research) pienin muutoksin. Lyhyesti sanottuna bisulfiitilla käsitelty DNA monistetaan käyttämällä spesifisiä PCR-alukkeita, jolloin PCR-tuotteet kloonataan ja sekvensoidaan.

EBV:n tunnistaminen Potilasnäytteissä olevat EBV-alatyypit arvioidaan käyttämällä kromogeenistä in situ -hybridisaatiomenetelmää (CISH) pienin muutoksin.

Yhden nukleotidin polymorfismin (SNP) analyysi Merkittävä osa GC-potilaista voi kehittää vakavaa toksisuutta 5-FU-hoidosta, mukaan lukien luuytimen supressio, neuropatia, alhainen valkosolujen määrä, kuume, infektiot, pahoinvointi, oksentelu, vaikea ripuli, suu ja ruoansulatuskanava tulehdus, jotka kaikki kirjataan muiden kohortien potilashistoriaan. Hienovaraiset henkilökohtaiset ja populaatiomuutokset DNA:ssa, joita kutsutaan SNP:iksi, voivat lisätä 5-FU-toksisuuden riskiä; 5-FU:n metabolia tapahtuu pääasiassa maksassa, jossa entsyymi DPYD on vastuussa >80 %:n lääkkeen metaboloinnista, jolloin muodostuu inaktiivinen metaboliitti 5,6-dihydroksi-5-FU. On laajalti dokumentoitu, että alentunut DPYP-aktiivisuus liittyy vakavaan toksisuuteen. 5-FU:n metaboloitumaton fraktio (20 %) transformoituu useilla entsyymeillä (esim. TP, TK), jolloin muodostuu aktiivisia metaboliitteja, jotka aiheuttavat TYMS:n eston, mikä edistää DNA/RNA-vaurioita. TYMS- ja MTHFR-geenien vaihtelut (liittyvät vähentyneeseen folaattisynteesiin, lisääntyneeseen 5-FU-vaikutukseen) on yhdistetty 5-FU-hoidon toksisuuteen. Geneettisten varianttien valintaan käytetty lähestymistapa koostui hausta PharmGKB-tietokannasta. Yhteensä kuusi ei-synonyymiä SNP:tä analysoidaan: neljä niistä sisältää DPYD-geenin, yksi TYMS:lle ja yksi MTHFR:lle. Analyysi suoritetaan käyttämällä TaqMan™ SNP Genotyping Assay -tekniikkaa (Applied Biosystems™). SNP:t arvioidaan DNA:sta, joka on eristetty parafiiniin upotetuista potilasnäytteistä.

Otoskoko ja tilastollinen analyysi

Näytteen vähimmäismäärä lasketaan sen varmistamiseksi, että hankkeen tavoitteet saavutetaan täysin. Ottaen huomioon, että noin 90 % GC-tapauksista on todellakin GAC:ta, 5 %:n virhetasolla ja 95 %:n luottamusvälillä tutkijat arvioivat alun perin 200 potilaan otoskoon. Tutkijat ovat kuitenkin huomioineet myös 15 %:n näytteiden menetysasteen (vialliset näytteet tai potilaan keskeyttäminen), mikä antoi yhteensä 230 potilasta rekrytointiin.

Vakiomuotoisia kuvaavia tilastoja käytetään analysoimaan kvalitatiivisia ja kvantitatiivisia muuttujia, kuten suhteellisia ja absoluuttisia frekvenssiä, taajuustaulukoita, keskiarvoa, mediaania, keskihajontaa, vaihteluväliä ja kvartiileja. 95 %:n luotettavuus katsotaan sopivaksi analyysiin. Kuvaavia tilastoja käytetään myös tärkeimpien mitattujen kliinisten parametrien luonnehtimiseen. Luokiteltujen muuttujien yhdistäminen suoritetaan chi-neliö- tai Fisherin tarkalla testillä. Yhden haaran varianssianalyysi vertailee jatkuvia muuttujia ryhmien välillä. Eloonjäämistulostutkimukset suoritetaan Kaplan-Meier-menetelmällä. Prognostiset tekijät arvioidaan Coxin verrannollisen vaaran regressiomallin mukaisesti.

Geenivarianttien pääkomponenttianalyysi (PCA) suoritetaan ja ensimmäisten pääkomponenttien assosiaatio pieneen ennalta määriteltyyn genomimuutostunnisteiden joukkoon arvioidaan. Molekyylialaryhmien määrittelemiseksi tutkijat käyttävät valvomatonta klusterointia. Molekyylialatyyppien korrelaatio kliinisen tiedon kanssa (esim. ikä, sukupuoli, Lauren-luokka) ja kliiniset tulokset (esim. kokonaiseloonjääminen, vasteprosentti) arvioidaan. Lisäksi valvottu luokittelu suoritetaan kliinisten tulosten perusteella ja molempien lähestymistapojen tuloksena saatuja ryhmiä verrataan muihin raportoituihin molekyylialatyyppeihin.

Potilassuoja/kirjalliset tietoon perustuvat suostumuslomakkeet

Kaikki osapuolet takaavat potilaiden henkilötietojen suojan. Potilaiden nimiä ei sisällytetä missään muodossa arkkiraportteihin, julkaisuihin tai minkään tyyppisiin tutkimuksesta johdettuun julkaistavaan dokumenttiin, lukuun ottamatta lain edellyttämiä asiakirjoja. Tietoon perustuvat suostumuslomakkeet laaditaan tiukasti lakien ja paikallisten määräysten mukaisesti. Sisäisen arviointilautakunnan/riippumattoman eettisen komitean ja CEMP:n on hyväksyttävä kirjalliset suostumuslomakkeet, mukaan lukien kaikki tutkimuksen aikana tehdyt muutokset, ennen kuin ne sisällytetään tutkimukseen.

Tutkijat, edustajat tai terveydenhuollon tarjoajat hankkivat kirjalliset tietoon perustuvat suostumuslomakkeet jokaiselta potilaalta tai lailliselta edustajalta ennen minkään tietyn tutkimuksen suorittamista.